JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52385
, , , ,
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology,School of Veterinary Medicine, University of California – Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory,School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Abstract

מתחם מיני אנופלס gambiae כולל המלריה העיקרית העברת יתושים באפריקה. כי מינים אלה הם בעלי חשיבות רפואית כגון, כמה תכונות הן בדרך כלל מאופיינות באמצעות מבחני מולקולריים לסיוע במחקרים אפידמיולוגיים. תכונות אלה כוללות זיהוי מינים, התנגדות חרקים, מצב זיהום טפיל, והעדפת מארח. מאז אוכלוסיות של מתחם אנופלס gambiae הן מורפולוגית נבדלו, תגובת שרשרת של פולימראז (PCR) משמשת באופן מסורתי לזיהוי מינים. ברגע שהמינים ידוע, כמה מבחני במורד הזרם מבוצעים באופן שיגרתי על מנת להבהיר מאפיינים נוספים. למשל, מוטציות הידועות כKDR בגן para להקנות עמידות נגד DDT וחומרי הדברה pyrethroid. בנוסף, מבחני צמודי אנזים immunosorbent (ELISAs) או מבחני PCR לגילוי DNA הטפיל Plasmodium המשמשים לאיתור טפילים הנמצאים ברקמות יתושים. לבסוף, combination של PCR ומעכל אנזים הגבלה ניתן להשתמש כדי להבהיר העדפת מארח (למשל, אדם לעומת דם בעלי חיים) על ידי הקרנת bloodmeal היתושים לDNA מארח ספציפי. פיתחנו assay רב-זיהוי (מד"א) שמשלב את כל מבחני הנ"ל ל33SNPs genotyping התגובה זמנית יחיד עבור 96 או 384 דגימות בכל פעם. בגלל מד"א כולל סמנים מרובים עבור מינים, זיהוי Plasmodium, וזיהוי דם מארח, הסבירות ליצירת תוצאות חיוביות או שליליים שגויות מופחתת במידה ניכרת ממבחנים קודמים הכוללים סמן אחת בלבד לכל תכונה. assay חזק וזה פשוט יכול לזהות תכונות יתוש מפתח אלה חסכוניים ובשבריר של הזמן של מבחני קיימים.

Introduction

arabiensis אנופלס, coluzzii אנופלס ואנופלס gambiae הם הווקטורים העיקריים האחראים להעברת מלריה באפריקה 1. שלושת מינים אלה הם מורפולוגית נבדלו 2 וניתן להבחין רק במבחנים מולקולריים 3-9. בנוסף, יש מבחני במורד הזרם רבים שנערכו באופן שגרתי כדי לסייע מחקרים אפידמיולוגיים וגנטיקת אוכלוסייה. אלה כוללים (1) assay genotyping לאיי התפצלות 10-12, (2) assay genotyping הכרת SNPs שאינו שם נרדף ב1,014 ה עמדת חומצת אמינו קודון של גן para (ההתנגדות לדפוק למטה, או kdr, SNP) 13 -18, (3) גילוי טפיל PCR 19-23, ו- (4) להקרנת DNA מארח ספציפי בmidguts יתוש 24,25.

פיתחנו assay רב-זיהוי (מד"א) שמשלב את כל מבחני הללו לתגובה זמנית בודדת במטרהalyzing מאפיינים חשובים אפידמיולוגיה של מלריה באפריקה. Assay מד"א כולל סמנים מרובים לאיתור (1) מין (arabiensis א, א gambiae, coluzzii א, או אחר (אף אחד משלוש)), (2) התנגדות החרקים המיוצגות בkdr SNPs (שני L1014F וL1014S) , (3) נוכחות של שני טפילי מלריה עיקריים, Plasmodium falciparum וP. vivax, ו- (4) מקור דם מעופות אחד ושישה מארחי יונקים.

באופן מסורתי, אלה מבחני נערכו בתגובות נפרדות שרשרת של פולימראז. כאשר כל אלה מבחני נעשים באמצעות פלטפורמת PCR קונבנציונלית, זה מחייב ביצוע 8-10 מבחני תגובת PCR ומלווה את צעדי ג'ל אלקטרופורזה. כל תגובת PCR בודדת מהכנה לתוצאות תיעוד לוקחת 4-5 שעות, ואילו שיטת מד"א שהוצגה כאן לוקחת בערך 5 שעות במכלול. זה שווה חיסכון של 90% בעלויות עבודה לבד. מד"א שהוצג כאן עולה 5 $לדגימה לגנוטיפ כל 33 SNPs. זה הרבה פחות יקר מאשר מבחני בודדים agarose מבוסס ג'ל, שעולים כ $ 1.50 לכל מדגם. מבחני איתור כל המאפיינים מכוסים על ידי מד"א ידרשו מינימום של 8-10 מבחני מבוססי ג'ל agarose נפרדים במחיר של 12-15 דולרים למדגם. יתר על כן, מד"א מקטין באופן משמעותי את הסיכוי ליצירת שקר חיובי או שלילי על ידי שימוש בלפחות שלושה סמנים לכל גילוי טפיל או מקור מארח.

הפלטפורמה שנוצלנו אינה מוגבלת למלריה, אבל ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים, כגון רפואה, רפואת וטרינרית, וביולוגיה בסיסית 26-28. במחקרים מעמיקים עמותה או גנטיקה של אוכלוסיות המחקרים שכללו מספר רב (לפי סדר 100s) של דגימות דורשים הקרנת מבחני עלות-תועלת לסמנים מרובים בו זמנית. רוב המחקרים שעושים שימוש בשניים או יותר מבחני PCR נפרדים יכולים ליישם את מד"א לתוצאות מהר יותר בעלות נמוכה יותר. </p>

Protocol

1. PCR הגברה מערבבים את כל צבעי יסוד PCR (ראה טבלת S1 המשלים) בmicrotube 1.5ml. לכל אחד יש שני SNP פריימרים (קדימה ואחורה). ודא שהמניה הריכוז של כל צבע יסוד PCR נשמר ב 100 מיקרומטר. לעשות מספיק תערובת פריימר ל500-1,000 תגובות להפחית pipetting שגיא?…

Representative Results

זיהוי מינים: 5 SNPs הבא ביחד לזהות שלושה מינים (arabiensis א, א coluzzii וא gambiae) (לוח 4). אם מדגם הוא לא אחד משלושת המינים, שלושה SNPs (01,073-213, 04,679-157 ו10313 -052) לא מצליחים להגביר. גנוטיפ kdr ?…

Discussion

מד"א מורכב מחמישה שלבים עיקריים: הגברה PCR, תגובת phosphatase אלקליין השרימפס (SAP), הארכת SNP, מוצר הארכת אוויר, וdesorption / יינון לייזר בסיוע מטריקס – זמן טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסת 33-37. צעד ההגברה PCR הראשון מגביר DNA איגוף כל SNP כך שתבנית ה- DNA מספיק יהיה זמין בשלב הארכת SNP. תג…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים בני הזוג. אנתוני קורנל ולורה נוריס בUC Davis וד"ר Katharina Kreppel באוניברסיטת גלזגו למתן דגימות יתושים מטנזניה. אנו מודים לגב 'Smita Das וד"ר דאגלס נוריס מבית הספר לג'ונס הופקינס לבריאות הציבור לשיתוף דגימות יתושים מזמביה. כמו כן, אנו מודים למר לי V. millon במעבדה לגנטיקה וטרינריים להכשרה בעיצוב assay. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק R01AI 078,183 וR21AI062929.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, d. e. l. l. a., A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  31. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  32. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  33. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  34. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  35. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  36. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  37. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  39. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  40. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  41. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  42. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Tags

Multi-detection AssayAnopheles GambiaeMalariaMosquitoesSpecies IdentificationInsecticide ResistancePlasmodium DetectionHost PreferencePCRELISAMultiplex Genotyping
check_url/pt/52385?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image