Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare
Summary
Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
Abstract
Il complesso di specie Anopheles gambiae include il principale malaria trasmissione zanzare in Africa. Poiché queste specie sono di tale importanza medica, alcuni tratti sono tipicamente caratterizzati mediante saggi molecolari per aiutare negli studi epidemiologici. Queste caratteristiche includono l'identificazione delle specie, resistenza agli insetticidi, lo stato di infezione del parassita, e la preferenza di accoglienza. Dal momento che le popolazioni del complesso Anopheles gambiae sono morfologicamente indistinguibili, una reazione a catena della polimerasi (PCR) è tradizionalmente utilizzato per identificare le specie. Una volta che la specie è nota, alcuni saggi a valle sono regolarmente eseguiti per chiarire ulteriori caratteristiche. Ad esempio, le mutazioni note come KDR in un gene para conferiscono resistenza contro DDT e insetticidi piretroidi. Inoltre, saggi immunoenzimatici (ELISA) o Plasmodium rilevazione del DNA del parassita PCR sono utilizzati per rilevare i parassiti presenti nei tessuti di zanzara. Infine, un combination di PCR e di restrizione con enzimi può essere usato per spiegare la preferenza host (ad esempio, umano contro sangue animale) per lo screening le farine di sangue di zanzara per DNA specifiche dell'host. Abbiamo sviluppato un saggio multi-rilevamento (MDA) che unisce tutti i saggi suddetti in un singolo multiplex 33SNPs reazione genotipizzazione per 96 o 384 campioni per volta. Perché il MDA include più marcatori per le specie, il rilevamento Plasmodium, e l'identificazione del sangue di accoglienza, la possibilità di generare falsi positivi o negativi è notevolmente ridotto da saggi precedenti che comprendono un solo marcatore per tratto. Questo test robusto e semplice può rilevare questi tratti zanzara chiave conveniente e in una frazione del tempo di saggi esistenti.
Introduction
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae sono i vettori principali responsabili della trasmissione della malaria in Africa 1. Queste tre specie sono morfologicamente indistinguibili 2 e si distinguono solo per saggi molecolari 3-9. In aggiunta, ci sono molti saggi a valle di routine condotte per aiutare genetica epidemiologici e demografici studi. Questi includono (1) un test di genotipizzazione per le isole di speciazione 10-12, (2) un test di genotipizzazione riconoscere SNP non sinonimo del 1014 ° aminoacido posizione codone del gene para (la resistenza knock-down, o KDR, SNP) 13 -18, (3) l'individuazione dei parassiti PCR 19-23, e (4) di screening per il DNA specifiche dell'host in midguts zanzara 24,25.
Abbiamo sviluppato un saggio multi-rilevamento (MDA) che unisce tutti questi saggi in una singola reazione multiplex con l'obiettivo di unalyzing caratteristiche epidemiologicamente importanti vettori della malaria in Africa. Il saggio MDA include più marcatori per la rilevazione (1) specie (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, o altro (nessuno dei tre)), (2) resistenza agli insetticidi rappresentato in KDR SNPs (sia L1014F e L1014S) , (3) presenza di due importanti parassiti della malaria, Plasmodium falciparum e P. vivax, e (4) fonte di sangue da un aviaria e sei ospiti mammiferi.
Tradizionalmente, questi saggi sono stati condotti in reazioni a catena della polimerasi separati. Quando tutti questi test vengono effettuati utilizzando una piattaforma tradizionale PCR, che richiede lo svolgimento di 8-10 PCR test di reazione e di accompagnamento gel elettroforesi passi. Ogni individuo reazione PCR dalla preparazione alla documentazione dei risultati richiede 4-5 ore, mentre il metodo MDA presentato qui richiede circa 5 ore nella sua totalità. Ciò equivale a un risparmio del 90% del costo del lavoro da solo. La MDA presentata qui costa 5 dollariper campione al genotipo tutti i 33 SNP. Questo è molto meno costoso che i test singoli a base di gel di agarosio, che costa circa $ 1.50 per campione. Saggi di rivelazione tutte le caratteristiche oggetto della MDA richiederebbe un minimo di 8-10 saggi basati gel di agarosio separati ad un costo di $ 12-15 per campione. Inoltre, la MDA riduce notevolmente la possibilità di generare un falso positivo o negativo utilizzando almeno tre marcatori per ogni rilevazione parassita o fonte host.
La piattaforma abbiamo utilizzato non è limitata a vettori malaria ma può essere utilizzato in un'ampia varietà di applicazioni come medicina, medicina veterinaria e biologia di base 26-28. Approfondimenti di associazione o di genetica di popolazione studi che coinvolgono un grande (in ordine di 100s) numero di campioni richiedono analisi di costo-efficacia di screening per più marcatori contemporaneamente. La maggior parte degli studi che utilizzano due o più PCR separati potrebbero attuare la MDA per risultati più rapidi a un costo inferiore. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
La MDA è composto da cinque fasi principali: PCR amplificazione, fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) di reazione, di estensione SNP, prodotto di estensione di condizionamento, e matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione – tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa 33-37. Il primo passo di amplificazione PCR amplifica DNA che fiancheggia ogni SNP in modo che abbastanza DNA modello sarà disponibile al passo estensione SNP. La reazione SAP neutralizza dNTP inutilizzati che possono interferire con…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Anthony Cornel e Laura Norris alla UC Davis e il Dr. Katharina Kreppel presso l'Università di Glasgow per la fornitura di esemplari di zanzara da Tanzania. Ringraziamo la signora Smita Das e il dottor Douglas Norris dalla Johns Hopkins School of Public Health per la condivisione di campioni di zanzara da Zambia. Ringraziamo anche il signor Lee V. Millon al Veterinary Genetics Laboratorio di formazione sulla progettazione del test. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health concedere R01AI 078.183 e R21AI062929.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |
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