JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Biologia

En Multi-deteksjon analysen for Malaria Sending Mygg

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52385
, , , ,
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology,School of Veterinary Medicine, University of California – Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory,School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Abstract

Anopheles gambiae arter Komplekset inneholder den store malaria overføring mygg i Afrika. Fordi disse arter er av en slik medisinsk betydning, karakterisert flere trekk er vanligvis ved hjelp av molekylære assays for å hjelpe til i epidemiologiske undersøkelser. Disse egenskapene inkluderer artsbestemmelse, insektmiddel motstand, parasitt infeksjon status, og vert preferanse. Siden populasjoner av Anopheles gambiae komplekset er ikke skilles morfologisk, er en polymerase kjedereaksjon (PCR) som tradisjonelt brukes for å identifisere arter. Når den art som er kjent, er flere nedstrøms-analyser rutinemessig utført for å belyse ytterligere kjennetegn. For eksempel mutasjoner kjent som KDR i en para-genet gir resistens mot DDT og pyretroide insektmidler. I tillegg, blir enzym-bundne immunosorbentbestemmelser (ELISA) eller plasmodiumparasitten DNA gjenkjenning PCR-analyser brukes til å detektere parasitter tilstede i mygg vev. Til slutt, en Oppkjøpn av PCR, og restriksjonsenzymdigere kan brukes til å belyse verts preferanse (f.eks human vs. dyreblod) ved screening av mygg bloodmeal for vertsspesifikk DNA. Vi har utviklet en multi-deteksjonsanalyse (MDA) som kombinerer alle de ovenfor nevnte analysene, til én multipleks reaksjonen genotyping 33SNPs for 96 eller 384 prøver på en gang. Fordi MDA inkluderer flere markører for arter, Plasmodium deteksjon, og vert blod identifikasjon, er sannsynligheten for å generere falske positiver eller negativer sterkt redusert fra tidligere analyser som omfatter bare én markør per trekk. Denne robuste og enkle analysen kan oppdage disse viktige myggtrekk kostnadseffektivt og i en brøkdel av tiden av eksisterende analyser.

Introduction

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii og Anopheles gambiae er de viktigste vektorer som er ansvarlige for malaria overføring i Afrika en. Disse tre artene er ikke skilles morfologisk 2 og kan bare skilles ved molekylære assays 3-9. I tillegg er det mange nedstrøms analyser rutinemessig gjennomført for å hjelpe epidemiologiske og populasjonsgenetikk studier. Disse omfatter (1) en genotyping analysen for arts øyer 10-12, (2) en genotyping analysen erkjenner ikke synonymt SNPs i 1014 th aminosyre kodon stilling para genet (knock-down motstand, eller kdr, SNP) 13 -18, (3) parasitt gjenkjenning PCR 19-23, og (4) screening for vertsspesifikk DNA i mygg midguts 24,25.

Vi utviklet en multi-gjenkjenning analysen (MDA) som kombinerer alle disse analysene til en enkelt multipleks reaksjon med mål om enalyzing epidemiologisk viktige kjennetegn ved malaria vektorer i Afrika. MDA analysen inkluderer flere markører for deteksjon (1) arter (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii eller annen (ingen av de tre)), (2) insektmiddel motstand representert i kdr SNPs (både L1014F og L1014S) , (3) nærværet av to store malariaparasitter, Plasmodium falciparum og P. vivax, og (4) blod kilde fra en avian og seks pattedyr verter.

Tradisjonelt ble disse analyser utført i separate polymerase kjedereaksjoner. Når alle disse analysene er gjort ved hjelp av en konvensjonell PCR plattform, krever det å drive 8-10 PCR reaksjons analyser og tilhørende gelelektroforesesystemer trinn. Hver enkelt PCR reaksjon fra forberedelse til å dokumentere resultater tar 4-5 timer, mens MDA Metoden som presenteres her tar ca 5 timer i helheten. Dette tilsvarer en 90% besparelse i lønnskostnader alene. MDA presenteres her koster $ 5per prøve å genotype alle 33 SNPs. Dette er betydelig rimeligere enn de enkle agarosegel baserte analyser, som koster ca $ 1,50 per prøve. Assays detektere alle kjennetegn som omfattes av MDA ville kreve et minimum av 8-10 separate agarosegel-baserte assays til en kostnad på $ 12 til 15 per prøve. Videre MDA reduserer sjansen for å generere et falskt positivt eller negativt ved å benytte minst tre markører for hver parasitt eller vertskilde deteksjon.

Plattformen vi utnyttet er ikke begrenset til malaria vektorer, men kan brukes i en rekke programmer som medisin, veterinærmedisin, og grunnleggende biologi 26-28. Inngående assosiasjonsstudier eller populasjonsgenetikk studier som involverer en stor (i rekkefølge av 100s) antall prøver krever kostnadseffektive analyser screening for flere markører samtidig. De fleste studier som bruker to eller flere separate PCR-analyser kunne implementere MDA for raskere resultater til en lavere kostnad. </p>

Protocol

1. PCR Amplification Bland alle PCR primere (Se utfyllende tabell S1) i en 1,5 ml mikrorør. Hver SNP har to primere (forover og bakover). Sørg for at aksjen konsentrasjonen av hver PCR primer holdes på 100 mikrometer. Gjør nok primerblanding for 500-1000 reaksjoner å redusere pipetteringsfeil og tid på benken (Se utfyllende tabell S2). Dersom det er ønskelig, forberede porsjoner for 100-200 reaksjoner per tube og oppbevares ved -20 ° C. Forbered PCR cocktail som beskrevet i produsentens prot…

Representative Results

Artsidentifisering: Følgende fem SNPs sammen identifisere tre arter (A. arabiensis, A. coluzzii og A. gambiae) (tabell 4). Dersom en prøve er ikke en av de tre artene, de tre SNPs (01073-213, 04679-157 og 10313 -052) ikke klarer å forsterke. kdr genotype for dedusere insektmiddel motstand: Den 1014 th kodon av para spenningsavhengige natriumkanal tils…

Discussion

MDA er sammensatt av fem store trinn: PCR forsterkning, reker alkalisk fosfatase (SAP) reaksjon, SNP forlengelse, utvidelse produkt condition, og matrise-assistert laserdesorpsjon / ionisering – flyvetid (MALDI-TOF) massespektrometri 33-37. Den første PCR amplifikasjonstrinn forsterker DNA flankerer hver SNP, slik at nok mal DNA vil være tilgjengelig på SNP forlengelse trinn. SAP reaksjon nøytraliserer ubrukte dNTPs som kan forstyrre følgende SNP forlengelse trinn. SNP forlengelse involverer en enkelt ek…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker legene. Anthony Cornel og Laura Norris ved UC Davis og Dr. Katharina Kreppel ved Universitetet i Glasgow for å gi mygg prøver fra Tanzania. Vi takker Ms Smita Das og Dr. Douglas Norris fra Johns Hopkins School of Public Health for å dele mygg prøver fra Zambia. Vi takker også Mr. Lee V. Millon ved Veterinær Genetics Laboratory for trening på analyse design. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health gi R01AI 078183 og R21AI062929.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, d. e. l. l. a., A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  31. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  32. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  33. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  34. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  35. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  36. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  37. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  39. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  40. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  41. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  42. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Tags

Multi-detection AssayAnopheles GambiaeMalariaMosquitoesSpecies IdentificationInsecticide ResistancePlasmodium DetectionHost PreferencePCRELISAMultiplex Genotyping
check_url/pt/52385?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image