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Biologia

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52385
, , , ,
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology,School of Veterinary Medicine, University of California – Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory,School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Abstract

O complexo de espécies Anopheles gambiae inclui a maior mosquitos transmissores da malária na África. Porque estas espécies são de tal importância médica, várias características são tipicamente caracterizados por meio de ensaios moleculares para auxiliar em estudos epidemiológicos. Essas características incluem a identificação das espécies, resistência a inseticidas, estado de infecção do parasita, e preferência de acolhimento. Dado que as populações do complexo Anopheles gambiae são morfologicamente indistinguíveis, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) é tradicionalmente usado para identificar as espécies. Uma vez que a espécie é conhecida, vários ensaios a jusante são rotineiramente realizados para elucidar outras características. Por exemplo, as mutações conhecidas como KDR em um gene par conferir resistência contra o DDT e piretróides. Além disso, ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA) ou Plasmodium ensaios de PCR de detecção do DNA do parasita são usados ​​para detectar parasitas presentes nos tecidos de mosquito. Por último, uma combinaçãn de PCR e digeridos com enzimas de restrição pode ser utilizado para elucidar preferência hospedeira (por exemplo, humano versus animais de sangue) por rastreio de farinha de sangue para mosquitos de ADN específico do anfitrião. Nós desenvolvemos um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos os ensaios acima mencionados numa única multiplex 33SNPs genotipagem reacção durante 96 ou 384 amostras de cada vez. Porque o MDA inclui vários marcadores para as espécies, a detecção de Plasmodium, e identificação sanguíneo hospedeiro, a probabilidade de gerar falsos positivos ou negativos é muito reduzida a partir de ensaios anteriores que incluem apenas um marcador por traço. Este ensaio robusto e simples pode detectar essas características-chave do mosquito de forma rentável e em uma fração do tempo de ensaios existentes.

Introduction

Arabiensis Anopheles, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae são os principais vetores responsáveis ​​pela transmissão da malária na África 1. Estas três espécies são morfologicamente indistinguíveis 2 e só pode ser distinguido por testes moleculares 3-9. Além disso, existem muitos ensaios a jusante rotineiramente realizados para auxiliar genética epidemiológicos e populacionais estudos. Estas incluem: (1) um ensaio de genotipagem para ilhas de especiação 10-12, (2) um ensaio de genotipagem reconhecendo SNPs não sinônimas no 1014 th posição do aminoácido códon do gene para (a resistência knock-down, ou kdr, SNP) 13 -18, (3) a detecção de parasitas PCR 19-23, e (4) de triagem para DNA específica do host no intestino médio do mosquito 24,25.

Foi desenvolvido um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos estes ensaios numa única reacção multiplex com o objetivo de umalyzing características epidemiologicamente importantes de vetores da malária em África. O ensaio MDA inclui múltiplos marcadores para a detecção (1) espécie (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, ou outro (nenhum dos três)), (2) a resistência aos inseticidas representada em kdr SNPs (ambos L1014F e L1014S) , (3) a presença de dois grandes parasitas da malária, Plasmodium falciparum e P. vivax, e (4) a partir de uma fonte de sangue aviária e seis hospedeiros mamíferos.

Tradicionalmente, estes ensaios foram realizados em reacções em cadeia de polimerase separadas. Quando todos esses ensaios são feitos usando uma plataforma PCR convencional, requer a realização de ensaios de reacção de PCR 10/08 e acompanha os passos de eletroforese em gel. Cada reação individual PCR de preparação para resultados documentando leva 4-5 horas, enquanto o método aqui apresentado MDA leva cerca de 5 horas em sua totalidade. Isto é equivalente a uma economia de 90% em custos de trabalho sozinho. O MDA apresentou aqui custa US $ 5por amostra de genotipagem de todos os 33 SNPs. Isto é consideravelmente mais barato do que as solteiras ensaios baseados em gel de agarose, que custa cerca de US $ 1,50 por amostra. Ensaios que detectam todas as características abrangidas pelo MDA requereria um mínimo de 8-10 ensaios separados baseadas em gel de agarose a um custo de $ 12-15 por amostra. Além disso, o MDA reduz grandemente a possibilidade de gerar uma falsa positiva ou negativa através da utilização de pelo menos três marcadores para cada parasita ou fonte de acolhimento de detecção.

A plataforma que utilizado não está limitado a vetores da malária, mas pode ser utilizado numa ampla variedade de aplicações, tais como a medicina, e medicina veterinária, e biologia de base 26-28. Em profundidade estudos de associação ou de genética de populações estudos envolvendo um grande número (em ordem de 100s) das amostras exigem ensaios rentáveis ​​triagem para múltiplos marcadores simultaneamente. A maioria dos estudos que utilizam dois ou mais ensaios de PCR separadas poderia implementar o MDA para resultados mais rápidos a um custo menor. </p>

Protocol

1. Amplificação por PCR Misturar todos os iniciadores de PCR (Ver Tabela S1 suplementar) em um microtubo de 1,5 mL. Cada SNP tem dois iniciadores (directo e inverso). Certifique-se de que a concentração de estoque de cada um dos iniciadores de PCR é mantida a 100 uM. Faça a mistura de iniciadores suficiente para 500-1.000 reações para reduzir pipetagem erro e tempo no banco (ver Tabela S2 suplementar). Se desejado, preparar alíquotas de 100-200 reacções por tubo, e armazenar a -20 ° C. P…

Representative Results

A identificação das espécies: Os cinco SNPs seguintes juntos identificar três espécies (A. arabiensis coluzzii A. e A. gambiae) (Tabela 4). Se a amostra não é uma das três espécies, os três SNPs (01073-213, 04.679-157 e 10313 -052) não conseguem amplificar. genótipo kdr para inferir resistência a inseticidas: A 1014 ° codão do canal de sódio p…

Discussion

O MDA é composto por cinco etapas principais: amplificação de PCR, fosfatase alcalina de camarão (SAP) de reacção, de extensão SNP, o produto de extensão condicionado, e de matriz assistida por laser de dessorção / ionização – tempo de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa de 33-37. O primeiro passo de amplificação de PCR amplifica ADN que flanqueia cada SNP, de modo que o ADN molde suficiente estará disponível no passo de extensão de SNP. A reação SAP neutraliza dNTPs não utilizados que…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Drs. Anthony Cornel e Laura Norris na UC Davis e Dr. Katharina Kreppel na Universidade de Glasgow para a prestação de espécimes de mosquitos da Tanzânia. Agradecemos Ms. Smita Das e Dr. Douglas Norris da Johns Hopkins School of Public Health para a partilha de amostras de mosquitos da Zâmbia. Agradecemos também o Sr. Lee V. Millon do Laboratório de Genética Veterinária para o treinamento no projeto ensaio. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder R01AI 078.183 e R21AI062929.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.
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Citar este artigo
Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).
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