Анализ Multi-обнаружения малярии комарами
Summary
Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
Abstract
Комплекс Anopheles gambiae видов включает в себя основную малярии комарами в Африке. Поскольку эти виды такого медицинское значение, несколько черт, как правило, характеризуется использованием молекулярных анализов, чтобы помочь в эпидемиологических исследованиях. Эти черты включают определение видов, стойкости к инсектицидам, состояние паразитарная инфекция, и предпочтение хозяина. Поскольку население комплекса Anopheles gambiae морфологически неразличимы, полимеразная цепная реакция (ПЦР) традиционно используются для идентификации видов. После того, как вид известен, регулярно проводится несколько ниже по течению анализы, чтобы выяснить дальнейшие характеристики. Например, мутации, известные как KDR в гене пара придает устойчивость к ДДТ и пиретроидов инсектицидов. Кроме того, фермент-иммуноферментный анализ (ИФА) или Plasmodium паразита обнаружения ДНК ПЦР используются для обнаружения паразитов, присутствующих в тканях комаров. Наконец, combinatioп ПЦР и рестриктаз дайджесты могут быть использованы для выяснения предпочтений хозяина (например, человеческая против крови животных) путем скрининга комаров bloodmeal для принимающей конкретных ДНК. Мы разработали анализ с несколькими обнаружения (MDA), который сочетает в себе все вышеперечисленные анализы в единый мультиплекс реакция генотипирования 33SNPs для 96 или 384 образцов одновременно. Потому что MDA включает в себя несколько маркеров для видов, выявление Plasmodium и принимающей идентификации крови, вероятность генерации ложных срабатываний или негативов значительно снижается по сравнению с предыдущими анализами, которые включают только один маркер за чертой. Этот надежный и простой анализ может обнаружить эти ключевые комаров черты экономически эффективно и в доли время существующие анализов.
Introduction
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii и Anopheles gambiae являются основными векторами, ответственные за передачу малярии в Африке 1. Эти три вида морфологически неотличимы 2 и может быть выделен только молекулярного анализа 3-9. Кроме того, есть много вниз по течению анализы регулярно проводимые чтобы помочь эпидемиологические и популяционные генетики исследований. Они включают в себя (1) определяют генотип анализ для видообразования островов 10-12 (2) генотипирование анализа признания, не синонимичные ОНП в 1014-м аминокислоты кодона положение гена пара (сопротивление нокдаун, или KDR, SNP) 13 -18 (3) обнаружения паразита ПЦР 19-23, и (4) Скрининг на хост-специфической ДНК в популяции комаров midguts 24,25.
Мы разработали анализ с несколькими обнаружения (MDA), который сочетает в себе все эти анализы в одном мультиплексной реакции с цельюalyzing эпидемиологически важных характеристик переносчиками малярии в Африке. MDA анализ включает в себя несколько маркеров для выявления (1) видов (A. arabiensis, А. gambiae, А. coluzzii, или другая информация (ни один из трех)), (2) устойчивости к инсектицидам, представленных в КДР ОНП (как L1014F и L1014S) (3) Наличие двух крупных малярийных паразитов, Plasmodium тропической и П. трехдневной, и (4) Источник крови одного птичьего гриппа и шесть хозяев млекопитающих.
Традиционно эти анализы были проведены в отдельных полимеразной цепной реакции. Когда все эти анализы сделаны с использованием обычной платформы ПЦР, что требует проведения реакции ПЦР 8-10 анализов и сопровождающих гель электрофореза шаги. Каждый человек ПЦР от подготовки к документированию результатов занимает 4-5 ч, в то время как метод MDA, представленные здесь занимает около 5 ч в совокупности. Это эквивалентно 90% экономии затрат на оплату труда в одиночку. MDA, представленные здесь стоит $ 5по образцу генотип все 33 ОНП. Это значительно дешевле, чем одиночных геля агарозы на основе анализа, который стоит около $ 1,50 за образец. Анализы выявления всех особенностей, охватываемые MDA потребует минимум 8-10 отдельных геля агарозы на основе анализов по цене $ 12-15 за образец. Кроме того, MDA значительно снижает вероятность получения ложно положительный или отрицательный, используя, по крайней мере три маркера для каждого паразита или источника Обнаружение хоста.
Платформа мы использовали не ограничивается переносчиков малярии, но может быть использован в широком спектре приложений, таких как медицине, ветеринарии, а также основной биологии 26-28. Углубленные исследования Ассоциации или популяционной генетики исследования с привлечением большого (в порядке 100s) число образцов требуют экономически эффективных анализов скрининга для одновременного нескольких маркеров. Большинство исследований, которые используют два или более отдельных ПЦР могли бы реализовать MDA для более быстрых результатов при меньших затратах. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
MDA состоит из пяти основных этапов: ПЦР-амплификации, креветки щелочной фосфатазы (SAP) реакции, расширения SNP, кондиционирования расширение продукт, и матрица-активированная лазерная десорбция / ионизации – времени пролета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии 33-37. Первый усиления стадия ПЦР у?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора. Энтони Корнел и Лора Норрис Калифорнийского университета в Дэвисе и доктора Катарина Kreppel в университете Глазго для обеспечения комаров образцы из Танзании. Мы благодарим г-жу Смита Дас и д-р Дуглас Норрис из школы Джона Хопкинса здравоохранения для обмена образцы комаров из Замбии. Мы также благодарим г-н Ли В. Millon в лаборатории генетики ветеринарной для обучения по дизайну анализа. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья грант R01AI 078183 и R21AI062929.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |
Referências
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
- Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
- Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, d. e. l. l. a., A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
- Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
- Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
- Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
- White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
- Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
- Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
- Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
- Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
- Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
- Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
- Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
- Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
- Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
- Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
- Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
- Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
- Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
- Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
- Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
- Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
- Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
- Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
- Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
- Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
- Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
- Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
- Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
- Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
- Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
- Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
- Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
- Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).
