JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

En Multi-detektion analys för Malaria Överföring Myggor

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52385
, , , ,
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology,School of Veterinary Medicine, University of California – Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory,School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Abstract

Den Anopheles gambiae arter Komplexet omfattar den stora malaria sänder mygg i Afrika. Eftersom dessa arter är av sådan medicinsk betydelse, finns flera drag vanligtvis karaktäriseras med molekylär analyser till stöd i epidemiologiska studier. Dessa egenskaper omfattar artbestämning, insektsresistens, parasitinfektion status, och värd önskemål. Eftersom populationer av Anopheles gambiae komplexet är morfologiskt oskiljbara, är en polymerase chain reaction (PCR) traditionellt används för att identifiera arter. När arten är känd, är flera nedströms analyser rutinmässigt för att belysa ytterligare egenskaper. Till exempel, mutationer kända som KDR i en para gen ger resistens mot DDT och pyretroidinsekticider. Dessutom är enzymkopplade immunsorbentanalyser (ELISA) eller Plasmodium parasit-DNA detektions PCR-analyser som används för att detektera parasiter som finns i mygga vävnader. Slutligen, en combination av PCR och restriktionsenzymdigereringar kan användas för att belysa värd preferens (t.ex., människa kontra djurblod) genom screening av mygga blodmjöl för värdspecifik DNA. Vi har utvecklat en multi-detekteringsanalys (MDA) som kombinerar alla av de ovannämnda analyserna i en enda multiplex reaktion genotypning 33SNPs för 96 eller 384 sampel i taget. Eftersom MDA innehåller flera markörer för arter, Plasmodium upptäckt, och värdblod identifiering, är sannolikheten för att generera falska positiva eller negativa kraftigt reducerad från tidigare analyser som inkluderar endast en markör per drag. Denna robusta och enkla analys kan upptäcka dessa nyckel mygga drag kostnadseffektivt och på en bråkdel av tiden av befintliga analyser.

Introduction

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii och Anopheles gambiae är de stora vektor ansvarar för malariatransporten i Afrika 1. Dessa tre arter är morfologiskt oskiljbara 2 och kan endast särskiljas genom molekylära analyser 3-9. Dessutom finns det många nedströms analyser rutinmässigt genomförda för att hjälpa epidemiologiska och populationsgenetiska studier. Dessa inkluderar (1) en genotypning analys för specieringsberäkningar öar 10-12, (2) en genotypning analys erkännande av icke-synonyma SNP i 1014: e aminosyran kodonposition av para-genen (knock-down motstånd eller KDR, SNP) 13 -18, (3) parasit detektering PCR 19-23, och (4) screening för värdspecifik DNA i mygga midguts 24,25.

Vi utvecklade en multi-detekteringsanalys (MDA) som kombinerar alla dessa analyser i en enda multiplex reaktion med målet av enalyzing epidemiologiskt viktiga egenskaper hos malaria vektorer i Afrika. I MDA-analysen innehåller flera markörer för att upptäcka (1) art (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii eller annan (ingen av de tre)), (2) insektsresistens representerade i KDR SNP (både L1014F och L1014S) , (3) närvaron av två stora malariaparasiter, Plasmodium falciparum och P. vivax, och (4) blodkälla från en höns och sex däggdjursvärdar.

Traditionellt har dessa analyser utfördes i separata polymeraskedjereaktioner. När alla dessa analyser görs med hjälp av en konventionell PCR-plattform, kräver det genomför 8-10 PCR-reaktionsanalyser och medföljande gelelektrofores steg. Varje enskild PCR-reaktion från förberedelser till dokumenterar resultaten tar 4-5 timmar, medan MDA metod som presenteras här tar ca 5 timmar i helhet. Detta motsvarar en 90% besparing i enbart arbetskostnader. MDA presenteras här kostar $ 5per prov till genotyp alla 33 SNP. Detta är betydligt billigare än de enskilda agarosgel baserade analyser, som kostar ca $ 1,50 per prov. Analyser som detekterar alla kännetecken som omfattas av MDA skulle kräva minst 8-10 separata agarosgel baserade analyser till en kostnad av $ 12-15 per prov. Dessutom MDA minskar avsevärt risken för att generera ett falskt positivt eller negativt genom att använda minst tre markörer för varje parasit eller värdkälla detektering.

Plattformen vi utnyttjade är inte begränsat till malaria vektorer men kan användas i en mängd olika tillämpningar som medicin, veterinärmedicin, och grundläggande biologi 26-28. Fördjupad associationsstudier eller populationsgenetik studier med en stor (i ordning efter 100s) antal prover kräver kostnadseffektiva analyser screening för flera markörer samtidigt. De flesta studier som använder två eller flera separata PCR-analyser kunde genomföra MDA för snabbare resultat till en lägre kostnad. </p>

Protocol

1. PCR-amplifiering Blanda alla PCR-primers (se kompletterande tabell S1) i en 1,5 ml mikrorör. Varje SNP har två primers (framåt och bakåt). Se till att stamkoncentration av varje PCR-primer hålls vid 100 ^ M. Gör tillräckligt primer mix för 500-1000 reaktioner att minska pipettering fel och tid på bänken (se kompletterande tabell S2). Om så önskas, förbereda portioner för 100-200 reaktioner per rör och förvara vid -20 ° C. Bered PCR cocktail som beskrivs i tillverkarens protokoll …

Representative Results

Artidentifiering: Följande 5 SNP tillsammans identifierar tre arter (A. arabiensis, A. coluzzii och A. gambiae) (Tabell 4). Om ett prov inte är en av de tre arterna, de tre SNPs (01.073 till 213, från 04.679 till 157 och 10313 -052) misslyckas med att förstärka. KDR genotyp för inferring insektsresistens: Den 1014: e kodon av para spänningsstyrda …

Discussion

MDA består av fem viktiga steg: PCR amplifiering, räkor alkaliskt fosfatas (SAP) reaktion, SNP förlängning, förlängningsproduktkonditione, och matrisassisterad laserdesorption / jonisering – flygtiden (MALDI-TOF) masspektrometri 33-37. Den första PCR-amplifiering steg förstärker DNA som flankerar varje SNP så att tillräckligt mall-DNA kommer att finnas tillgängliga på SNP förlängningssteg. SAP reaktionen neutraliserar oanvända dNTP som kan störa den följande SNP förlängningssteget. SNP fö…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Drs. Anthony Cornel och Laura Norris vid UC Davis och Dr. Katharina Kreppel vid University of Glasgow för att ge mygga prover från Tanzania. Vi tackar Ms Smita Das och Dr. Douglas Norris från Johns Hopkins School of Public Health för att dela mygga prov från Zambia. Vi tackar även Mr Lee V. Millon vid Veterinär Genetics Laboratory för träning på analys design. Detta arbete stöddes av National Institute of Health bevilja R01AI 078.183 och R21AI062929.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, d. e. l. l. a., A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  31. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  32. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  33. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  34. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  35. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  36. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  37. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  39. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  40. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  41. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  42. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Tags

Multi-detection AssayAnopheles GambiaeMalariaMosquitoesSpecies IdentificationInsecticide ResistancePlasmodium DetectionHost PreferencePCRELISAMultiplex Genotyping
check_url/pt/52385?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image