Valutare l'efficacia delle Cancer Drug Sensibilizzazione<em> In Vitro</em> E<em> In Vivo</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
Dato l'elevato livello di eterogeneità e di mutazioni inerenti tumori umani, terapie singoli agenti, o regimi di associazione che prendono di mira la stessa via, sono destinate a fallire. L'accento deve essere posto sulla inibizione di percorsi che sono responsabili per la resistenza intrinseca e / o adattabile alla terapia. Un campo di ricerca attiva è lo sviluppo e la sperimentazione di inibitori di riparazione del DNA che promuovono l'azione di, e prevenire la resistenza a, comunemente chemioterapia e la radioterapia utilizzata. Abbiamo utilizzato un nuovo protocollo per valutare l'efficacia di inibizione BRCA2 come mezzo per sensibilizzare le cellule tumorali al DNA dannoso cisplatino farmaco. Metabolismo cellulare tumorale (acidificazione e respirazione) è stata monitorata in tempo reale per un periodo di 72 ore per delineare efficacia del trattamento su un minuto da basi minuti. In combinazione, abbiamo effettuato una valutazione della frequenza metastatico con una membrana corioallantoidea embrione di pollo (CAM) il modello di stravaso e l'invasione. Questoprotocollo affronta alcuni dei punti deboli di uso comune in vitro e in vivo i metodi per valutare nuovi regimi di terapia del cancro. Può essere utilizzato in aggiunta ai metodi comuni come saggi di proliferazione cellulare, saggi di morte cellulare, e studi in vivo xenotrapianto murini, discriminare più strettamente tra target e agenti candidati, e selezionare solo i candidati più promettenti per ulteriore sviluppo.
Introduction
Resistenza mirata e / o trattamento del cancro citotossico è un importante problema clinico che può portare al fallimento del trattamento, ricaduta acquisita, e un aumento della mortalità del paziente 1. Dato l'elevato livello di eterogeneità nella maggior parte dei tumori, è una certezza matematica che un tumore del numero sufficientemente elevato di cellule conterrà un sottoinsieme di cellule resistenti alle terapie singole o combinate rivolte vie molecolari in cui tali cellule dipendono per la sopravvivenza 2,3. Tali cellule tumorali possono essere selezionate positivamente per durante il trattamento, determinando una recidiva di malattia. Sviluppo di nuove terapie che contemporaneamente colpiscono diversi meccanismi di sopravvivenza delle cellule del cancro, prima o dopo la selezione del trattamento-mediata, è quindi clinicamente importante.
Un alto livello di instabilità del genoma e la mutazione nei genomi tumorali è una caratteristica fondamentale che distingue le cellule tumorali da cellule ospiti non-tumorali 4. Di conseguenza, un usefustrategia l per aumentare l'efficacia delle attività lesiva sul DNA chemioterapia e per prevenire lo sviluppo di resistenza è di inibire attivamente la riparazione del DNA nelle cellule tumorali 5. Si tratta di un tema di indagine e una varietà di nuovi bersagli di riparazione del DNA vengono esplorati in un contesto pre-clinico. Un certo numero di piccole molecole o inibitori a base antisenso-di questi obiettivi sono stati sviluppati e in attesa di collaudo 6-8. L'obiettivo è quello di individuare le più promettenti candidati pre-clinici e valutare la loro sicurezza ed efficacia in studi clinici.
L'alto costo degli studi clinici e il rischio di fallimento (per una serie di motivi, tra cui la valutazione pre-clinica non ottimale) sono formidabili ostacoli al progresso nello sviluppo di nuove terapie 9. L'uso di modelli adeguati e rigorosi pre-clinico per valutare adeguatamente nuovi bersagli terapeutici e farmaci candidati può diminuire il tasso di fallimento delle sperimentazioni cliniche 10 </sup>.
Alcuni metodi pre-clinici di uso comune per valutare l'efficacia di nuovi regimi anti-cancro sono: a) la misura di capacità di ridurre la proliferazione delle cellule tumorali in vitro (saggi di proliferazione cellulare), b) la riduzione della terapia indotta della capacità delle cellule tumorali di colonie di coltura tissutale (forma saggi formazione di colonie), c) la riduzione terapia indotta in cellule tumorali attività metabolica in vitro (conversione redox-dye), d) induzione terapia indotta vitro morte delle cellule tumorali de (apoptosi, necrosi, autophagic, associato con la mitosi e altri) 11, ed e) in vivo riduzione della crescita o ablazione umano e topo eterotrapianti 12-14 terapia indotta.
Una delle principali debolezze dei metodi elencati in vitro è che nessuno di loro forniscono valutazione continua in tempo reale l'effetto di terapie candidati. Piuttosto, forniscono informazioni solo in selezionati, momenti ampiamente separatidurante il corso del trattamento. Tali misurazioni sono diminuiti capacità di riflettere con precisione l'entità e la tempistica delle risposte delle cellule tumorali. In vivo i modelli del mouse xenotrapianto sono limitati da costi elevati, la lunghezza di tempo per completare, e il rischio di dosaggio e trattamento tempistica sub-ottimali (scheduling). Inoltre, vi sono prove che i modelli roditori xenotrapianto sono predittori limitati di efficacia clinica negli esseri umani, rispetto alla valutazione in vitro delle risposte delle cellule primarie tumorali umane e stabilite linee cellulari tumorali umane a candidati interventi terapeutici 15,16.
Abbiamo ideato un protocollo nuova combinazione di valutare nuove combinazioni di farmaci pre-clinica, in modo che affronta le debolezze delle procedure più comuni elencati sopra. In luogo di proliferazione, formazione di colonie, o redox-dye test di conversione, abbiamo utilizzato un'unità di misura del metabolismo di analizzare l'adesione delle cellule, la respirazione, e l'acidificazione in tempo realedurante l'intero periodo di trattamento 17. Allo stesso tempo, abbiamo studiato gli effetti della combinazione di trattamento in vivo, utilizzando un embrione di pollo corioallantoidea membrana (CAM) il modello di invasione e metastasi 18,19. Abbiamo usato questi metodi per valutare la capacità di un oligonucleotide antisenso (ASO) rivolti BRCA2 potenziare l'efficacia del cisplatino farmaco chemioterapico comunemente usato.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa del costo inerente e rischi associati a test clinici, vi è la necessità di sviluppare una migliore e più rigorosa metodologia di test pre-clinici per valutare adeguatamente nuovi regimi di trattamento anti-cancro. Attuali tecniche comunemente utilizzate tutte debolezze mostrano che possono limitare la loro capacità di discriminare tra potenzialmente promettenti terapeutici target / agenti, e quelli che possono essere meno efficaci. Abbiamo ideato un protocollo per valutare nuovi approcci anti-tumorali che af…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato reso possibile da finanziamenti a JK dei Centri di eccellenza dell'Ontario e del Fondo di ricerca Ontario.
Vorremmo ringraziare Siddika Pardhan e il Dr. Peter Ferguson per l'assistenza tecnica durante le riprese.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
Referências
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