Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

Soizic Garaud; Chunyan Gu-Trantien; Jean-Nicolas Lodewyckx; Anaïs Boisson; Pushpamali De Silva; Laurence Buisseret; Edoardo Migliori; Myriam Libin; Céline Naveaux; Hugues Duvillier; Karen Willard-Gallo

doi:10.3791/52392

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Artigo de método

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

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DOI:

10.3791/52392

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6 de dezembro de 2014

Soizic Garaud^*¹^,² , Chunyan Gu-Trantien^*¹^,² , Jean-Nicolas Lodewyckx¹^,² , Anaïs Boisson¹^,² , Pushpamali De Silva¹^,² , Laurence Buisseret¹^,² , Edoardo Migliori¹^,² , Myriam Libin³ , Céline Naveaux¹^,² , Hugues Duvillier¹^,⁴ , Karen Willard-Gallo¹^,²

¹Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, ²Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, ³Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, ⁴Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a dissociação rápida não enzimática de fragmentos de tecido humano fresco para avaliação qualitativa e quantitativa de células CD45⁺ (linfócitos/leucócitos) presentes em vários tecidos humanos normais e malignos. Além disso, o sobrenadante obtido do homogeneizado de tecido primário pode ser coletado e armazenado para análise ou experimentação posterior.

Resumo

A capacidade das células malignas para evadir o sistema imune, caracterizado por escape do tumor a partir de ambas as respostas imunes inatas e adaptativas, é agora aceite como uma característica importante do cancro. Nossa pesquisa sobre câncer de mama centra-se no papel ativo que os linfócitos tumor infiltrando desempenhar na progressão do tumor e evolução de pacientes. Com esse objetivo, foi desenvolvida uma metodologia para o rápido isolamento de células linfóides intactas de tecidos normais e anormais em um esforço para avaliá-los próximo ao seu estado natal. Homogeneizados preparados utilizando um show Dissociator mecânica tanto maior recuperação e viabilidade celular, preservando a expressão do receptor de superfície em comparação tecidos para enzima-digerida. Além disso, a digestão enzimática do material insolúvel restante não recuperou células adicionais CD45 ^+, indicando que as medidas quantitativas e qualitativas no homogeneizado primária provável genuinamente refletem infiltrando as subpopulações no fragm tecidoent. As células linfóides em homogenatos estes podem ser facilmente caracterizadas utilizando imunológica (fenótipo, proliferação, etc.) ou molecular (DNA, RNA e / ou proteína) se aproxima. As células CD45 ⁺ pode também ser utilizado para a purificação subpopulação, expansão in vitro ou de criopreservação. Um benefício adicional desta abordagem é que o sobrenadante de tecido primário a partir dos homogeneizados podem ser utilizados para caracterizar e comparar as citocinas, quimiocinas e imunoglobulinas, antigénios presentes em tecidos normais e malignos. Este funções de protocolo extremamente bem para tecidos mamários humanos e deve ser aplicável a uma grande variedade de tecidos normais e anormais.

Introdução

O microambiente tumoral é composto por vários tipos de células, com numerosos estudos mostrando que cada uma delas desempenha papéis distintos e importantes na tumorigênese^1,2. Estes incluem, mas não estão limitados a, células imunes infiltrantes, células estromais, células endoteliais e células tumorais³. Estudos ex vivo de linfócitos infiltrantes tumorais (TIL; Células CD45⁺ ou leucócitos, que são predominantemente linfócitos em tumores de mama) de amostras frescas de tecido humano é dificultado por sua baixa frequência, os pequenos tamanhos de amostra frequentemente disponíveis para pesquisa e o potencial de perda de viabil....