جيل من الخلايا T CAR للعلاج بالتبني في سياق ورم أرومي دبقي مستوى الرعاية
Summary
The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Abstract
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
Introduction
ورم أرومي دبقي (GBM) هو ورم خبيث في الدماغ الأولية الأكثر شيوعا وغير قاتلة دائما. فشل استئصال الجراحي إلى جانب معيار غير محددة من العلاج الكيميائي الرعاية والعلاج الإشعاعي للقضاء تماما الخلايا الخبيثة، مما أدى إلى التكهن الكئيب أقل من 15 شهرا في المرضى الذين يعانون من هذا المرض 1. في المقابل، العلاج المناعي يقدم نهجا دقيقا لاستهداف الخلايا السرطانية على وجه التحديد، وبالتالي لديه القدرة لتكون بمثابة منصة علاج فعال للغاية مع تقليص خطر التعرض للسمية ضمانات 2-4. خلايا T هندستها خارج الحي للتعبير عن مستقبلات المستضد خيالية (سيارات) تقدم استراتيجية متعددة الجوانب لالورم المناعي. يتم إنشاء السيارات عن طريق دمج المنطقة المتغيرة خارج الخلية من الأجسام المضادة مع خلية واحدة أو أكثر داخل الخلايا T يشير جزيء (ق)، وذلك بدلا من كامل طول التوافق النسيجي الرئيسي المعقدة (MHC) -restricted T الخلايا مستقبلات 5. هذا النمط من مثل الأجسام المضادة مستضد recognitiعلى يسمح للخلايا T مستضد معين رد الفعل على الاعتراف والاستجابة لمستضدات الأورام في غياب MHC ويمكن تكييفها لمستضد ذخيرة لانهائية تقريبا.
وقد أظهرت خلايا CAR T المهندسة ضد مجموعة متنوعة من مستضدات الأورام فعالية قبل السريرية ووعد المتميز في العيادة 6-9. على وجه التحديد، في سياق GBM، وهي تستهدف CAR منصة الخلايا T عامل نمو البشرة مستقبلات البديل الثالث (EGFRvIII)، أعربت طفرة ورم محددة على سطح الخلية 10، وقد تبين لإطالة بقاء في الحاملة للدبقي الفئران 11. وعلى الرغم من تعدد استعمالاتها، ومع ذلك، فإن فائدة سريرية من CAR العلاج بالتبني لم تتحقق بالكامل، ويرجع ذلك جزئيا إلى كبت المناعة المرتبط الورم والتهرب المناعة 12-16 وكذلك التحديات في إنشاء وصيانة خلايا T مستضد معين في الجسم الحي. يمكن الاستفادة من مستوى الرعاية (SOC) مع العلاج المناعي يحتمل التغلب على العديد من هذه لترالمقلدة، مما أدى إلى تعزيز فعالية في كل من الإعداد قبل السريرية والسريرية.
SOC لمرحلة ما بعد استئصال-GBM يتكون من temozolomide جرعة عالية (TMZ)، وهو DNA وكيل مؤلكل 17، وأشعة الدماغ كله (معهد البنك الدولي) 1. يفترض هذه العلاجات إلى تضافر مع اللقاحات الورم عبر upregulation من ورم MHC التعبير 18-20 وسفك المستضدات من قبل الخلايا السرطانية الميتة 17،19،21،22. في الواقع، إضافة TMZ 20،23 أو 18،24 معهد البنك الدولي يؤدي إلى تعزيز فعالية مضادة للورم من العلاجات القائمة على جهاز المناعة في الإعداد قبل السريرية. وعلاوة على ذلك، مثل العديد من مبحث المعالجة الكيميائية السامة للخلايا غير محددة، ومن المعروف TMZ أن تسبب النظامية 25،26 اللمفاويات، والتي يمكن الاستدانة كوسيلة لتكييف المضيف لمنصات العلاج بالتبني 27-29. وقد تبين lymphodepletion TMZ بوساطة لتعزيز وتيرة وظيفة الخلايا T مستضد معين، مما يؤدي إلى زيادة فعالية من adopمنصة العلاج موانع ضد الأورام داخل الجمجمة 30. في سياق العلاج CAR، يخدم lymphodepletion كوسيلة لتكييف المضيف من قبل كل من خفض عدد القامع الذاتية خلايا تي 31، ويحفز انتشار استتبابي 32 عن طريق تقليل المنافسة على السيتوكينات 33، وبالتالي تعزيز النشاط انتيتومور 11،34. نظرا للعلاقة تعاونية بين GBM SOC والعلاج المناعي المنصات، وتقييم رواية العلاجات بالتبني ومنصات لقاح في سياق SOC أمر بالغ الأهمية لاستخلاص استنتاجات ذات مغزى بشأن فعالية.
في هذا البروتوكول، ونحن الخطوط العريضة لطريقة لتوليد وإدارة وريدية من خلايا T CAR EGFRvIII محددة الفئران جنبا إلى جنب مع TMZ ومعهد البنك الدولي في الفئران الحاملة الأورام داخل الجمجمة EGFRvIII إيجابية (انظر الشكل رقم 1 لجدول زمني العلاج). لفترة وجيزة، مصنوعة خلايا T CAR السابقين الجسم الحي من قبل تنبيغ فيروسات. الكلى الجنينية البشرية (HEK) 2و transfected 93T الخلايا باستخدام مجمع DNA / الدهون (التي تحتوي على ناقلات CAR والبلازميدات PCL للبيئة) لإنتاج الفيروس، الذي يستخدم بعد ذلك لتنبيغ splenocytes الفئران تنشيط التي يتم حصادها وتربيتها بشكل متواز. خلال جيل CAR، وتدار المضيفين الفئران تحمل الأورام داخل الجمجمة EGFRvIII إيجابية مجزأة كامل الدماغ إشعاع الأشعة السينية والعلاج TMZ النظامية في جرعات مماثلة لSOC السريري. ثم يتم تسليم CAR T الخلايا عن طريق الوريد إلى المضيفين lymphodepleted.
يتم وصف الإجراء التالي في سبع مراحل منفصلة: (1) إدارة Temozolomide إلى الفئران، (2) كامل التشعيع الدماغ من الفئران الحاملة للورم، الحاملة للورم (3) ترنسفكأيشن، (4) استئصال الطحال والخلايا التائية إعداد و(5 ) تنبيغ، (6) ثقافة خلية CAR T والحصاد، و (7) إدارة خلية CAR T إلى الفئران الحاملة للورم. وتتألف هذه المراحل من العديد من الخطوات التي تمتد 6-7 أيام ويتم تنفيذ متزامن.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تصميم الجدول الزمني العلاج الموصوفة هنا إلى النموذج القياسي السريري الرعاية والاستفادة من آثارها لCAR العلاج بالتبني. CAR T جرعات خلية، نظم TMZ، وإدارة العلاج الإشعاعي يمكن تعديلها لتعزيز في الجسم الحي T نشاط الخلايا، lymphodepletion، وقتل الورم. نظم TMZ يمكن زيادة لا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
| 200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
| GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
| Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
| 100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
| Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
| Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |
Referências
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
- Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
- Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
- Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
- Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
- Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
- Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
- Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
- Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
- Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
- Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
- Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
- Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
- Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
- Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
- Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
- Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
- Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
- Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
- Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
- Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
- Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
- Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
- Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
- Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
- Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
- Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
- Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
- Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
- Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
- Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
- Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
- Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).
