Syntetisk Metodik för Asymmetric Ferrocen Härledda Bio-konjugerade system via Solid Phase Harts-metodik

Summary

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Abstract

Tidig upptäckt är nyckeln till framgångsrik behandling av de flesta sjukdomar, och är särskilt viktigt för diagnos och behandling av många typer av cancer. De vanligaste teknikerna som används är avbildningsmetoder såsom magnetisk resonanstomografi (MRT), Positron Emission Topografi (PET), och Computed topografi (CT) och är optimala för att förstå den fysiska strukturen av sjukdomen men kan endast utföras en gång varje fyra till sex veckor på grund av användningen av avbildningsmedel och totalkostnad. Med detta i åtanke, ^pt utveckling av "vårdplatsen" tekniker, såsom biosensorer, vilket utvärdera sjukdomsstadium och / eller effekt behandling i läkarens kontor och göra det i tid, skulle revolutionera behandlingsprotokoll. Som ett sätt att utforska ferrocen baserade biosensorer för detektering av biologiskt relevanta molekyler ² har metoder utvecklats för att producera ferrocen-biotin bio-konjugat som beskrivs häri. Denna rapport kommer att fokusera på en biotin-ferrocen-cystein system som kan immobiliseras på ett guld yta.

Introduction

Biosensorer är små enheter som använder biomolekylär erkännande teknik som plattform för selektiv analys och utnyttjas för deras specificitet, hastighet och låg kostnad. Elektrokemiska biosensorer för detektering av biomolekyler är i spetsen för detta område på grund av sin enkelhet, kostnadseffektivitet och hög känslighet. ^1,3 Den allmänna anatomi dessa sensorer är en elektrod försedd med ett igenkänningsmolekyl specifik för den biologiska markör av intresse . Bindning av biomarkör av igenkännande molekyl resulterar i en lokal förändring av potential eller ström som kan detekteras genom en enkel mätning. Hittills igenkänningsdelen kan variera från enzymer, ^4-8 antikroppar, ^9-12 hela celler, 13-16 receptorer, ^17-20 peptider ^21-23 och DNA ²⁴ och har till stor del fokuserat på större, biologiska molekyler. ^25-28 Forskning insatser i denna arena har koncentrerat huvudsakligen på immunosensorer where ett immunglobulin immobiliseras med en redox-aktiv kärna (såsom ferrocen) och användes för att detektera en antikropp av intresse. Dessa studier har exkluderats från kliniska tillämpningar på grund av dålig precision och tidsåtgång som härrör från de komplikationer som uppstår vid användning av antigen / antikroppar. ^1,3 Växande uppmärksamhet har fokuserat på att upptäcka små molekyler (mindre än 1 kg / mol) biomedicinsk , mat och miljöintresse utöver den nationella säkerheten. ²⁹ De mest kända exemplen på biosensor enheter är självtest glukosmätare, som har screentryckta enzymelektroder kopplade till en fickformat amperometrisk mätare. Dessa system använder vanligtvis en coulometrisk metod där den totala mängden laddning som genereras av glukos oxidationsreaktionen mäts över en tidsperiod. Omsättnings enheter måste vara portabel, robust och handhållna att använda lättköpt för befolkningen i stort.

Redox taggar såsom ferrocen är necessary att ge elektrokemisk detektion av biomarkörer eller små molekyler i lösning som de flesta biomarkörer inte i sig elektrokemiskt aktiva. ^30-38 Ferrocen är en metallorganisk molekyl som är en guldstandard för elektrokemi, vilket gör det till ett utmärkt val för integration i elektrokemiska biosensorer. Ferrocen-baserade redoxaktiva arter har redan rönt stor uppmärksamhet på grund av sin ringa storlek, god stabilitet, bekväm syntetiskt tillgång, enkel kemisk modifiering, relativ lipofilicitet och enkel redox tuning. ^3,30-42 Små molekyler baserade på ferrocen kärnan har använts i stor utsträckning som detektorer av metalljoner och små molekyler. ^32-38,43 System riktar större arter såsom biomolekyler har utnyttjat fastsättning av stora antikroppar eller immunglobuliner till ferrocenderivat som har inbäddade på en elektrokemisk yta. ^{1,3,39 , 44} I varje fall potentialen och ström intensity av Fe ^III / Fe ^II redoxparet ändrades på molekylär koppling, vilket ger en ny spektroskopisk handtag tyder på förekomst av analytmolekylen. Denna förändring beror på den omfattande överlappningen som uppstår mellan pi-system av cyklopentadienylringarna och järn d-orbitaler. Om PI-systemet ändras, dvs derivatiserad eller reageras, då orbital interaktion kommer, i sin tur, förändring. Detta kommer att påverka Fe kärnan och kan observeras som en förskjutning i potential Fe ^III / Fe ^II par. ^40,45,46 Dessa egenskaper gör ett sådant system attraktivt för användning som kvantifiera medel i en elektrokemisk immun eller biosensor.

För att producera ferrocen innehållande system specifika för biosensor kapaciteter det är optimalt att modifiera en Cp-ringen med den biologiska receptorn specifik för en målmolekyl och utnyttja den andra Cp-ringen som en molekylär tjuder till den elektrokemiska utläsningen eller electrampade (Figur 1). Syntes av dessa asymmetriska ferrocenderivat utmanas av sidoreaktioner och bildandet av dimera och polymera arter bildas vid intertvärbindning. ⁴⁷ är dock kopplingskemi producerar en amidbindning den rakaste vägen att ge enkla derivat av ferrocen med biologiska komponenter sådana som peptider och deras metaboliter. Därför kan fastfastekniker först utvecklades på 1950-talet av Merrifield för peptidsyntes appliceras på metallorganiska föreningar innehållande ferrocen. Genom användningen av den ortogonalt substituerade 1'-Fmoc-amino-ferrocen-1-karboxylsyra-molekyl, en ferrocen system som kan innehålla en receptorgrupp (biotin), elektrokemisk utläsning (ferrocen) och immobilisera-linkerkomponent (cystein) har byggts och närmare häri. Syntesen av denna biologiska konjugat diskuteras liksom bevis för immobilisering på ett guld yta. Detta arbete företräts den första presentationen av ett system som består av biotin, ferrocen och en aminosyra för immobilisering på en guldyta.

Protocol

1. Syntes av biotin-Fc-cystein (1) Fast fas metoder för att framställa hartsbunden 1. Placera biotin laddad harts (250 mg, 0,145 mmol) i en frittad spruta och svälla hartset genom att utarbeta dimetylformamid (5 ml) och skaka sprutan på ett labb shaker i 20 min. Utvisa lösningen och upprepa dimetylformamid svullnad en gång till. Avlägsna Fmoc-skyddsgruppen genom tillsats 4-6 ml 20% piperidin i dimetylformamid till sprutan, följt av 10-15 min av skakning. Upprepa avs…

Representative Results

Den hartsbundna formen av en visas i figur 2. Den kovalenta infästningen av ferrocen komponent ger upphov till en orange nyans till de hartspärlor som är långlivat med kontinuerlig tvättning och indikativ för en immobiliserad järninnehållande komplexet i motsats till järn absorptionen av PEG-komponenten av hartspärla. Hartset fria formen av en är identisk i färg till hartskuloma. Efter avlägsnande av föreningen från harts-pärlor, är renheten och utbytet…

Discussion

Syntesen av asymmetriska ferrocenderivat utmanar i lösning. Exempelvis har försök att producera pt i lösning resulterade i låga utbyten av den önskade produkten (mindre än 20%). Likaså reaktioner utnyttjar 1'-amino-ferrocenkarboxylsyra (sans Fmoc) och hartsbundna biotin ledde olöslig produkt som överensstämmer med den polymeriserade produkten rapporterats av Baristic et al. och minimal produkt. ⁴⁷ Detta kompliceras ytterligare av ferrocen och dess derivat är …

Materials

Biotin Novatag Resin	NovaBiochem	8550510001
TORVIQ 10ML LUER LOCK FRITTED SYRINGE	Fisher	NC9299151
piperdine	Acros	P/3520/PB05
ninhydrin test	Sigma-Aldrich	60017-1ea
1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid	Omm Scientific	Special Order
1-​Hydroxybenzotriazole hydrate	Sigma-Aldrich	157260-25G
N,N′-Diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407-5G
N,N-​Diisopropylethylamine	Sigma-Aldrich	496219-100ML
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Novabiochem	8520080025
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T5408
1,2-ethanedithiol	Sigma-Aldrich	2930
triisopropyl silane	Sigma-Aldrich	233781
Eppendorf tubes (20 mL)	any source
methanol	any source		dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
dichloromethane	any source		dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
dimethylformamide	any source		dry with molecular sieves prior to use & store in 100 mL media bottle for easy usage.
centrifuge	any source