A sedimentação de equilíbrio de uma proteína de membrana de formação de oligómero pequeno: Efeito de Histidina A protonação em pentamérica Estabilidade

Resumo

O equilíbrio de sedimentação (SE) pode ser usado para estudar as interações proteína-proteína em um ambiente fisiológico. Este manuscrito descreve o uso desta técnica para determinar o efeito do pH na estabilidade de um homopentâmero formado pela pequena proteína hidrofóbica (SH) codificada pelo vírus respiratório sincicial humano (hRSV).

Resumo

Ultracentrifugação analítica (AUC) pode ser usado para estudar as interacções reversíveis entre macromoléculas sobre uma ampla gama de forças de interacção e em condições fisiológicas. Isso faz com que AUC um método de escolha para avaliar quantitativamente estequiometria e termodinâmica dos homo e hetero-associação que são transitórias e reversíveis nos processos bioquímicos. Na modalidade de equilíbrio de sedimentação (SE), um equilíbrio entre difusão e sedimentação fornece um perfil como uma função da distância radial que depende de um modelo de associação específica. Nisto, um protocolo detalhado SE é descrita para determinar a energia associação tamanho e monómero-monómero de uma pequena oligómero de proteína de membrana usando uma ultracentrífuga analítica. ES-AUC é livre de marcador, apenas com base em princípios físicos, e pode ser usado em ambas as proteínas solúveis da membrana e água. Um exemplo é mostrado deste último, o pequeno hidrofóbico (SH) nas proteínas do vírus sincicial respiratório humano (HRSV), Um polipeptídeo de ácido 65-amino com um único transmembranar (TM) de domínio helicoidal-α que forma canais de iões pentaméricos. Dados estrutural à base de RMN mostra que a proteína tem duas SH protonável resíduos de His no seu domínio transmembranar que são orientados de frente para o lúmen do canal. SE experimentos foram concebidos para determinar como pH afeta constante de associação e do tamanho da proteína oligomérica SH. Embora a forma pentamérica foi preservada em todos os casos, a sua constante de associação foi reduzida a pH baixo. Esses dados estão de acordo para uma dependência de pH semelhante ao observado para atividade canal SH, consistente com uma orientação do lúmen das duas Seus teor de resíduos no proteína SH. Este último pode experimentar repulsão eletrostática e estabilidade oligômero reduzida em pH baixo. Em resumo, este método é aplicável sempre que a informação quantitativa sobre proteína-proteína subtis alterações de associação em condições fisiológicas têm de ser medidos.

Introdução

Ultracentrifugação analítica ^1-5 é um dos métodos mais importantes para estudar as interações de macromoléculas em condições fisiológicas, sendo acessível para ambas as interações fracas e fortes. O método é livre-label e utiliza a absorção de luz ou interferência, e até mesmo sistemas ópticos de fluorescência pode ser usado para acessar faixas de concentração ao longo de várias ordens de magnitude ^6.

Este método é especialmente útil, pois a maioria dos processos bioquímicos dependem de interações reversíveis. A estequiometria e resistência destas interacções têm de ser quantitativamente caracterizada para compreende....

Protocolo

Este protocolo é baseado nos seguintes recursos, que devem ser encaminhados para mais detalhes e considerações especiais ^{3, 25-28.}

1. Densidade de harmonização de micelas detergentes com ² _H2O

Nota: A densidade da solução tampão deve ser adaptada à densidade das micelas detergentes. Agentes de ajuste de densidade comuns incluem ² H ₂ O, ₂ H ¹⁸ O, ² H ₂ O ^18, glicerol e sacarose ^29. H ₂ O ¹⁸ tem a mesma densidade que ² H ₂ O e pode ser uma escolha mel....

Resultados

O perfil radial de distribuição C14SB micelas detergentes em Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,3, forma um exponenciais muito raso que poderiam ser ajustados a um modelo linear (Figura 7A). O declive desta distribuição está inversamente correlacionada com a concentração de D ₂ O (Figura 7B). O ponto em que o declive é zero, ou seja, o correspondente D ₂ O concentração, verificou-se ser de 32,3%.

Veja a Figura 7 abaixo.

Discussão

Este documento fornece um protocolo experimental para a preparação e análise de oligomerização de uma pequena proteína de membrana em detergente usando equilíbrio sedimentação da amostra. O protocolo descrito é igualmente válido para -e simpler- proteínas solúveis, como o passo correspondente da densidade não é necessária. Com efeito, o sistema é constituído por uma mistura de detergente e da proteína. Para realizar estudos de sedimentação, o detergente deve estar invisível para o campo gravitacional, de modo que não co.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3- (N,N-dimetilmiritilamônio)propanossulfonato	Sigma	T0807
Óxido de deutério 99,8%	Isótopo de Cambridge	DLM-4-99,8
Rotor An-50 Ti, Analítico, 8 Lugares	Beckman Coulter	363782
An-60 Ti Rotor, Analítico,	4 Lugares Beckman Coulter	361964
Carcaça de célula	Beckman Coulter
Centro de mesa de seis canais de 12 mm,	Beckman Coulter	331376
Porta de janela	Beckman Coulter	305037
Junta de janela	Beckman Coulter	327021
Forro de janela	Beckman Coulter	362329
Janela de safira	Beckman Coulter	307177
Janela de quartzo	Beckman Coulter	301730
Arruela de anel de parafuso	Beckman Coulter	362328
Anel de parafuso	Beckman Coulter	301922
Spinkote	Beckman Coulter	306812
Conjunto de suporte de torque	Beckman Coulter	361318
Contrapeso	Beckman Coulter	360219
Ferramenta de alinhamento celular	Beckman Coulter	362340
SEDNTERP			http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis			http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm
SEDPHAT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm

334784Epon a carvão