الترسيب التوازن من البروتين غشاء صغير قليل وحدات تشكيل: تأثير الحامض الأميني إضافة بروتون على Pentameric الاستقرار
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
تنبيذ فائق التحليلية (AUC) يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات بين الجزيئات عكسها على مجموعة واسعة من نقاط القوة التفاعل وتحت الظروف الفسيولوجية. وهذا يجعل من الجامعة الأمريكية بالقاهرة وسيلة لاختيار لتقييم كمي رياضيات الكيمياء والديناميكا الحرارية من هومو ومغاير الجمعية التي هي عابرة وقابلة للانتكاس في العمليات الكيميائية الحيوية. في طريقة الترسيب التوازن (SE)، توازن بين نشر والترسيب ويقدم لمحة بوصفها وظيفة من المسافة الشعاعية التي تعتمد على نموذج جمعية محدد. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة SE لتحديد حجم ومونومر-مونومر الطاقة جمعية صغيرة قليل وحدات البروتين غشاء باستخدام نابذة فائقة السرعة التحليلية. AUC-ES هي خالية من التسمية، استنادا فقط على المبادئ الفيزيائية، ويمكن استخدامها على كل من المياه القابلة للذوبان البروتينات والأغشية. ويرد مثال على هذا الأخير، ومسعور (SH) بروتين صغير في الفيروس المخلوي التنفسي للإنسان (hRSV)، وهو حمض أميني ببتيد 65-مع-α حلزونية عبر الغشاء (TM) مجال واحد التي تشكل القنوات الأيونية pentameric. وتظهر بيانات الهيكلي القائم NMR التي البروتين SH اثنين protonatable صاحب المخلفات في مجال الغشاء لها التي يتم الموجهة التي تواجه تجويف القناة. وقد تم تصميم التجارب SE لتحديد كيفية تأثير درجة الحموضة ثابتة الجمعيات وحجم بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين SH. في حين تم الحفاظ على شكل pentameric في جميع الحالات، تم تخفيض ثابتة ارتباطه في انخفاض الرقم الهيدروجيني. هذه البيانات هي في الاتفاق مع تبعية درجة الحموضة المماثلة الملحوظة للنشاط قناة SH، بما يتفق مع التوجه lumenal من اثنين صاحب المخلفات في البروتين SH. قد تواجه هذا الأخير التنافر الكهربائي وتقليل الاستقرار قليل وحدات في انخفاض الرقم الهيدروجيني. وباختصار، هذا الأسلوب هو المعمول به كلما معلومات كمية عن التغييرات الطفيفة جمعية البروتين البروتين في الظروف الفسيولوجية يجب أن تقاس.
Introduction
تنبيذ فائق التحليلية 1-5 هو واحد من أهم الأساليب لدراسة تفاعلات الجزيئات في ظل الظروف الفسيولوجية، ويجري في متناول كل من التفاعلات الضعيفة والقوية. هذه الطريقة خالية من التسمية ويستخدم امتصاص الضوء أو تدخل، وحتى النظم البصرية مضان يمكن استخدامها للوصول إلى نطاقات التركيز على مدى عدة أوامر من حجم 6.
هذه الطريقة مفيدة خصوصا لأن معظم العمليات الكيميائية الحيوية تعتمد على التفاعلات عكسها. رياضيات الكيمياء وقوة هذه التفاعلات يجب أن يتميز من الناحية الكمية لفهم العمليات البيولوجية، ويوجد عدد من الطرق لهذا الغرض 7 و 8. ومع ذلك، تفاعلات عابرة يصعب دراسة 9.
اختيار طريقة لوصف تفاعلات الجزيئات يعتمد على طبيعته ثابتة أو متغيرة. في الحالة الأولى، sedim ويستخدم entation سرعة (SV)، حيث يتم قياس معدل النقل شعاعي ومجزأة المجمعات على أساس الاختلافات في كتلة ازدهار والشكل.
في المقابل، الجمعيات الديناميكية التي عكسها على مقياس الساعة من التجربة لا يمكن فصلها جسديا. في هذه الحالة، الذاتي أو مغاير التفاعلات التي تؤدي إلى تفاعلات غير التساهمية هي في التوازن الذي يعتمد على تركيز البروتين الكلي. هذه التفاعلات الديناميكية يمكن دراستها من قبل كل من توازن الترسيب (SE) وسرعة الترسيب (SV) 10. ومع ذلك، الأسلوب الأول هو أبسط لأداء ويوصف هنا. في SE، يتم تنفيذ الطرد المركزي على سرعة منخفضة بما فيه الكفاية بحيث يتم التوصل إلى توازن بين نشر والترسيب. في هذه المرحلة، والوضع توازن إشارة ضوئية (UV-VIS) كدالة للمسافة شعاعي، ويمكن تحليلها باستخدام نماذج الحرارية المحددة مسبقا للجمعيات 11.
ve_content "> في هذه الورقة، وقدم دراسة الترسيب التوازن للجمعية الذاتي للبروتين الغشاء الفيروسية التي تشكل أيون القنوات. وبسبب للا مائية لها، يتم تشغيل التجربة في وجود المنظفات، وفي هذه الحالة كثافة لديها مذيب لتكون مطابقة لتلك التي من المنظفات. ومع ذلك، وصف بروتوكول من شأنه متطابقة في حالة وجود البروتين للذوبان في الماء، إلا أنه لا مطابقة كثافة المذيبات سيكون مطلوبا.يتم ترميز البروتين المستخدمة في الجهاز التنفسي البشري الفيروس المخلوي (hRSV)، وهو pneumovirus يلفها عائلة الفيروسات المخاطانية الذي يسبب انخفاض مرض الجهاز التنفسي عند الرضع والمسنين والسكان المناعة في جميع أنحاء العالم 12. ما يصل إلى 64 مليون سهم سجلت حالات العدوى hRSV و160،000 حالة وفاة تحدث سنويا.
الجينوم hRSV المحاضر 11 البروتينات، بما في ذلك البروتينات الغشاء ثلاثة F، G، والصغيرة مسعور (SH). ويشارك البروتين SHفي التسبب في العدوى RSV. كان RSV تفتقر إلى الجين SH (RSVΔSH) قابلة للحياة، وتسبب تشكيل syncytia ونما وكذلك البرية من نوع (WT) فيروس 13-16. ومع ذلك، تكرار فيروس RSVΔSH 10 أضعاف أقل كفاءة من WT في الجهاز التنفسي العلوي 15 و 16. أيضا، تم الموهن فيروس RSVΔSH في الماوس في الجسم الحي ونماذج الشمبانزي 13 و 17.
البروتين SH هو (RSV فرعية A) 64 أو 65 (RSV فرعية B) الأحماض الأمينية نوع طويل II بروتين الغشاء لا يتجزأ التي تتراكم في الغالب في أغشية مقصورة جولجي 18. البروتين SH وتوقع واحد عبر الغشاء (TM) المجال حلزونية 19 التي يتم حفظها للغاية 20،21. تتوجه C- وN-محطة المجالات extramembrane lumenally / خارج الخلية وcytoplasmically، على التوالي.
كلا مجال TM الاصطناعية (بقايا 18-43) وكامل طول البروتين SH وقد ثبت لتشكيل homopentamers في مجموعة متنوعة من المنظفات. شكل homopentameric هي المسؤولة عن النشاط قناة في طبقات ثنائية الدهون مستو 22،23. تم تحديد الاتجاه الصحيح للأحادية TM في طبقة ثنائية الدهون أولا باستخدام الموقع ازدواج اللون الأشعة تحت الحمراء محدد 23، والذي أظهر صاحب-22 ليكون في lumenal، على مقربة من بين حلزونية، والتوجه. وأكد نفس TM التوجه المجال عن طريق دراسات الرنين المغناطيسي النووي التي أعيد بناؤها في pentameric ل-حلزونية حزمة من البروتين كامل طول في dodecylphosphocholine (DPC) المذيلات 22. في هذا النموذج "مذيلة"، وكان يحيط واحد أ- نطاق TM حلزونية N-الميؤوس من قبل لحلزون، وC-عضال لا شفاء منه موسعة ب-دبوس الشعر. بقايا protonatable اثنين من البروتين SH، صاحب-22 وصاحب-51، وتقع في المجال TM (الموجهة lumenally)، وفي غيض من extramembrane-C محطة β دبوس (بعيدا عن مسام قناة)، على التوالي. في بيئى bicellarnment، ومع ذلك، فإن TM-α الحلزون يمتد حتى صاحب-51، وكلاهما صاحب المخلفات يمكن الوصول إلى تجويف القناة 24 ساعة. هيكل قناة يتبنى بنية تشبه القمع 22، حيث المنطقة أضيق (سر-29 إلى السيستئين-45) واصطف 22 مع سلاسل الجانب مسعور (إيل-32، إيل 36، إيل 40 ولوي-44)، و إيل-36 يحدد أضيق نقطة في تجويف القناة. يقع له-22 في أكبر افتتاح هذا القمع، في حين أن صاحب-51 هو في غيض من أصغر الافتتاح.
في هذه الورقة، وقد استخدمت الطرد المركزي التحليلي في وضع الترسيب التوازن لتحديد ما إذا كان إضافة بروتون صاحب يؤثر على استقرار مخموس البروتين SH. في هذه الحالة، كان يذوب البروتين SH في المنظفات C14-البيتين، والتي تم استخدامها سابقا لإظهار أن أشكال البروتين SH الأوليغومرات pentameric 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكول تجريبي لإعداد العينات وتحليل oligomerization من البروتين غشاء صغير في المنظفات باستخدام توازن الترسيب. بروتوكول صفها صالح -وعلى simpler- للبروتينات قابلة للذوبان على حد سواء، كما لا يشترط الخطوة كثافة مطابقة. في الواقع، يتكون النظام من خلال خليط من الم…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
Referências
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. . Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions – Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- . . An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. . Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
