Sedimentatie Evenwicht van een Kleine Oligomeer-vormende membraaneiwit: Effect van histidine Protonering op pentamere Stabiliteit
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
Analytische ultracentrifugatie (AUC) kan worden gebruikt om reversibele interactie tussen macromoleculen over een breed scala van interactie sterke en onder fysiologische omstandigheden te bestuderen. Dit maakt AUC een methode van keuze om kwantitatief te beoordelen stoichiometric en thermodynamica van homo- en hetero-vereniging die van voorbijgaande aard en omkeerbaar in biochemische processen zijn. In de modaliteit van sedimentatie evenwicht (SE), een evenwicht tussen diffusie en sedimentatie levert een profiel als functie van de radiale afstand die afhankelijk is van een specifiek associatiemodel. Hierin wordt een gedetailleerd SE protocol beschreven om het formaat en monomeer-monomeer associatie energie van een klein membraaneiwit oligomeer met een analytische ultracentrifuge bepalen. AUC-ES-label vrij, enkel op basis van fysische principes, en kan worden gebruikt zowel wateroplosbare en membraaneiwitten. Een voorbeeld wordt getoond van de laatste kleine hydrofoob (SH) eiwit in het menselijk respiratoir syncytieel virus (HRSV), Een 65 aminozuur polypeptide met een α-helix transmembraan (TM) domein dat pentameer ionenkanalen vormen. NMR-gebaseerde structurele gegevens blijkt dat SH eiwit twee protoneerbare His residuen in het transmembraan domein dat georiënteerd tegenover het lumen van het kanaal. SE experimenten werden ontworpen om te bepalen hoe pH beïnvloedt associatieconstante en de oligomere grootte van SH eiwit. Terwijl de pentamere vorm werd bewaard in alle gevallen werd de associatieconstante gereduceerd bij lage pH. Deze gegevens zijn in overeenstemming met een vergelijkbare pH-afhankelijkheid waargenomen voor SH kanaal activiteit, consistent met een lumenale oriëntatie van de twee Zijn residuen in SH-eiwit. Dit laatste kan bij lage pH elektrostatische afstoting en verminderde stabiliteit oligomeer ervaren. Kortom, deze werkwijze geldt wanneer kwantitatieve gegevens over subtiele eiwit-eiwit associatie veranderingen in fysiologische omstandigheden moeten worden gemeten.
Introduction
Analytische ultracentrifugatie 1-5 is een van de belangrijkste methoden interacties van macromoleculen onderzoeken onder fysiologische omstandigheden toegankelijk is voor zowel zwakke en sterke interacties. De methode is-label vrij en maakt gebruik van licht absorptie of interferentie, en zelfs fluorescentie optische systemen kunnen worden gebruikt om toegang te krijgen concentratietrajecten over verschillende ordes van grootte 6.
Deze methode is bijzonder nuttig omdat de meeste biochemische processen afhankelijk omkeerbaar interacties. De stoichiometrie en sterkte van deze interacties kwantitatief gekarakteriseerd worden om biologische processen te begrijpen, en een aantal methoden bestaan hiervoor 7, 8. Echter, voorbijgaande interacties moeilijk te bestuderen 9.
De keuze van een werkwijze macromoleculaire interacties te karakteriseren afhankelijk van de statische of dynamische karakter. In het eerste geval, Sedim entatie snelheid (SV) gebruikt, waarbij de mate van radiale transport wordt gemeten en complexen worden gefractioneerd op basis van verschillen in groeiende massa en vorm.
In tegenstelling, dynamische verenigingen die omkeerbaar zijn op de tijdschaal van het experiment niet fysiek kunnen worden gescheiden. In dit geval, zelf- of hetero-interacties leiden tot niet-covalente interacties in een evenwicht dat afhankelijk is van de totale eiwitconcentratie. Deze dynamische interacties kunnen worden onderzocht door zowel sedimentatie evenwicht (SE) en sedimentatie snelheid (SV) 10. De eerste methode is eenvoudiger uit te voeren en wordt hier beschreven. In SE, wordt centrifugeren uitgevoerd bij een voldoende lage snelheid zodat een evenwicht wordt bereikt tussen diffusie en sedimentatie. Op dit punt het evenwicht profiel van een optisch signaal (UV-VIS) als functie van de radiale afstand, kan worden geanalyseerd met vooraf ingestelde thermodynamische modellen voor verenigingen 11.
ve_content "> In het onderhavige document, sedimentatie evenwicht studie gegeven van de zelf-associatie van een virale membraaneiwit dat vormt ionenkanalen. Vanwege de hydrofobiciteit, wordt het experiment uitgevoerd in aanwezigheid van detergens, en in dit geval de dichtheid van oplosmiddel worden aangepast aan die van het detergens. De beschreven protocol zou identiek bij een water oplosbaar eiwit, behalve dat geen oplosmiddelen dichtheid overeenkomende zou zijn.Het eiwit gebruikt wordt gecodeerd in het menselijk respiratoir syncytieel virus (HRSV), een omhuld pneumovirus in de Paramyxoviridae familie die onderste luchtwegen aandoeningen bij zuigelingen, ouderen en immuungecompromitteerde bevolkingen wereldwijd 12 veroorzaakt. Maximaal 64 miljoen gemelde gevallen van HRSV infectie en 160.000 sterfgevallen per jaar.
De HRSV genoom transcribeert 11 eiwitten, waaronder de drie membraan eiwitten F, G en klein hydrofoob (SH). SH-eiwit is betrokkenin de pathogenese van RSV-infectie. RSV zonder het SH-gen (RSVΔSH) levensvatbaar, veroorzaakte vorming van syncytia en groeide als het wildtype (WT) virus 13-16. Echter, RSVΔSH virus gerepliceerd 10-voudig minder efficiënt dan de WT in de bovenste luchtwegen 15, 16. Ook werd RSVΔSH virus verzwakt in vivo muis en chimpansee modellen 13, 17.
De SH-eiwit is een 64 (RSV subgroep A) of 65 (RSV subgroep B) aminozuren lang type II integraal membraaneiwit dat voornamelijk accumuleert in de membranen van het Golgi 18. SH eiwit heeft een voorspeld a-spiraalvormige transmembraan (TM) domein 19 die is sterk geconserveerd 20,21. De C- en N-terminale domeinen extramembrane cytoplasmatisch respectievelijk lumenally / extracellulair en georiënteerd.
Beide synthetische TM domein (residuen 18-43) En de volledige lengte SH-eiwit is aangetoond dat homopentamers in verschillende detergentia te vormen. De homopentameric vorm is verantwoordelijk voor kanaal activiteit in vlakke lipidendubbellagen 22,23. De correcte oriëntatie van de TM monomeren in de lipide bilaag werd eerst bepaald middels plaatsspecifieke infrarood dichroïsme 23, waaruit bleek His-22 in een lumen, dicht bij inter-spiraalvormige oriëntatie. Dezelfde TM domein oriëntatie werd bevestigd door NMR studies dat de pentamere reconstrueerde-helix bundel van het eiwit van volledige lengte in dodecylphosphocholine (DPC) micellen 22. In deze "micel-model, werd een a- schroeflijnvormige TM domein N-terminaal geflankeerd door een a-helix en C-terminaal van een uitgebreide B-haarspeld. De twee protoneerbare residuen van SH eiwit, His-22 en His-51 worden in de TM domein (lumenally georiënteerd), en aan het uiteinde van de extramembrane C-terminale β haarspeld (ver van de zender porie), respectievelijk. In een bicellar Envirooverschrijdende aanpak echter de TM α-helix strekt zich uit tot His-51, en beide zijn resten zijn toegankelijk voor het lumen van het kanaal 24. De kanaalstructuur neemt een trechtervormig architectuur 22, waarbij het smallere gebied (Ser-29, Cys-45) 22 is bekleed met hydrofobe zijketens (Ile-32, Ile-36, Ile-40 en Leu-44), en definieert Ile-36 het smalste punt in het kanaal lumen. His-22 bevindt zich op de grootste opening van de trechter, terwijl His-51 aan het uiteinde van de kleinste opening.
In dit document, is analytische centrifugatie in een sedimentatie evenwicht modus gebruikt om te bepalen of zijn protonering beïnvloedt de stabiliteit van de SH eiwit pentameer. In dit geval werd SH eiwit opgelost in C14-betaine detergent, die eerder gewend SH eiwit vormt oligomeren pentameer 22 tonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit document biedt een experimenteel protocol voor de monstervoorbereiding en analyse van oligomerisatie van een kleine membraaneiwit in detergent behulp evenwicht sedimentatie. De beschreven protocol is evenzeer -en simpler- voor oplosbare eiwitten, zoals de dichtheid matching stap niet vereist. Inderdaad, wordt het systeem gevormd door een mengsel van afwasmiddel en eiwit. Sedimentatie studies moet het detergens onzichtbaar voor het gravitatieveld zodat het niet bijdraagt aan het deeltje flotatie. Zo is de dicht…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
Referências
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. . Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions – Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- . . An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. . Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
