L'équilibre de sédimentation d'une Membrane Protein Petit Oligomer formation: Effet de l'histidine Protonation sur pentamériques stabilité

Summary

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Abstract

Ultracentrifugation analytique (AUC) peut être utilisé pour étudier les interactions entre macromolécules réversible sur une large gamme de forces d'interaction et dans des conditions physiologiques. Cela rend AUC une méthode de choix pour évaluer quantitativement stoechiométrie et thermodynamique des homo- et hétéro-association qui sont transitoires et réversibles dans les processus biochimiques. Dans la modalité de l'équilibre de sédimentation (SE), un équilibre entre la diffusion et la sédimentation présente un profil en fonction de la distance radiale qui dépend d'un modèle d'association spécifique. Ici, un protocole détaillé est décrit SE afin de déterminer la taille et de monomère-monomère association énergie d'une petite oligomère de protéine de membrane en utilisant une ultracentrifugeuse analytique. AUC-ES-étiquette est libre, basé uniquement sur des principes physiques, et peut être utilisé sur les deux protéines solubles et membranaires eau. Un exemple est illustré de celle-ci, la petite hydrophobe (SH) à la protéine de virus syncytial respiratoire humain (hRSV), Un polypeptide de 65 acides aminés avec un seul transmembranaire (TM) de domaine α-hélicoïdale qui forme des canaux ioniques pentamères. Sur la base des données de structure RMN montre que la protéine SH a deux résidus His protonable dans son domaine transmembranaire qui sont orientés face de la lumière du canal. SE expériences ont été conçues pour déterminer comment le pH affecte constante d'association et de la taille oligomères de la protéine SH. Bien que la forme pentamérique a été préservée dans tous les cas, sa constante d'association a été réduite à un pH faible. Ces données sont en accord avec un pH dépendance similaire observée pour l'activité des canaux SH, conformément à une orientation luminale des deux résidus His dans la protéine SH. Ce dernier peut éprouver une répulsion électrostatique et la stabilité d'oligomères réduite à faible pH. En résumé, cette méthode est applicable à chaque fois que des informations quantitatives sur les changements subtils association protéine-protéine dans des conditions physiologiques doivent être mesurés.

Introduction

Ultracentrifugation analytique ^1-5 est une des méthodes les plus importantes pour étudier les interactions des macromolécules dans des conditions physiologiques, étant accessibles à la fois aux interactions faibles et forts. Le procédé est sans marqueur et utilise l'absorption de lumière ou d'interférences, et même des systèmes optiques de fluorescence peut être utilisée pour accéder à des plages de concentration de plusieurs ordres de magnitude ^6.

Cette méthode est particulièrement utile étant donné que la plupart des processus biochimiques dépendent des interactions réversibles. La stoechiométrie et la force de ces interactions doivent être caractérisée quantitativement à comprendre des processus biologiques, et un certain nombre de méthodes existent à cette fin ^{7, 8.} Cependant, les interactions transitoires sont difficiles à étudier ^neuf.

Le choix d'une méthode pour caractériser les interactions macromoléculaires dépend de sa nature statique ou dynamique. Dans le premier cas, Sedim vitesse de entation (SV) est utilisé, où le taux de transport radial est mesuré et complexes sont fractionné sur la base des différences de masse flottante et la forme.

En revanche, les associations dynamiques qui sont réversibles sur l'échelle de temps de l'expérience ne peuvent pas être physiquement séparés. Dans ce cas, l'auto-hétéro ou interactions conduisant à des interactions non covalentes sont dans un équilibre qui dépend de la concentration totale en protéines. Ces interactions dynamiques peuvent être étudiés à la fois l'équilibre de sédimentation (SE) et de la vitesse de sédimentation (SV) ^10. Toutefois, le premier procédé est plus simple à réaliser et est décrite ici. Dans SE, la centrifugation est réalisée à une vitesse suffisamment basse de sorte qu'un équilibre est atteint entre la diffusion et la sédimentation. À ce stade, le profil d'équilibre d'un signal optique (UV-VIS) en fonction de la distance radiale, peut être analysé en utilisant des modèles thermodynamiques prédéfinis pour les associations ^11.

ve_content "> Dans le présent document, une étude de sédimentation à l'équilibre est présenté de l'auto-association d'une protéine de membrane virale qui forme canaux ioniques. En raison de son caractère hydrophobe, l'expérience est conduite en présence d'un détergent, et dans ce cas, la densité de solvant doit être adaptée à celle du détergent. Cependant, le protocole décrit serait identique dans le cas d'une protéine soluble dans l'eau, à l'exception qu'aucun solvant de recherche de densité serait nécessaire.

La protéine utilisée est codé dans le virus respiratoire syncytial humain (hRSV), un pneumovirus enveloppé dans la famille de paramyxoviridae qui cause la maladie des voies respiratoires inférieures chez les nourrissons, les personnes âgées et les populations immunodéprimées dans le monde entier ^12. Jusqu'à 64 millions de cas déclarés d'infection hRSV et 160 000 décès surviennent chaque année.

Le génome de hRSV transcrit 11 protéines, y compris les trois protéines membranaires F, G, et petite hydrophobe (SH). protéine SH est impliquédans la pathogenèse de l'infection par le VRS. RSV dépourvu du gène SH (de RSVΔSH) était viable, a provoqué la formation de syncytia et a grandi ainsi que le type sauvage (WT) virus ^13-16. Cependant, le virus RSVΔSH reproduit 10 fois moins efficace que le WT dans le tractus respiratoire supérieur ^{15, 16.} En outre, le virus a été atténuée dans RSVΔSH chez la souris in vivo et des modèles de chimpanzés ^{13, 17.}

La protéine SH est un groupe (sous-groupe de RSV A) 64 ou 65 (VRS sous-groupe B) acides aminés II protéine de membrane intégrale qui se accumule principalement dans les membranes de Golgi le compartiment ¹⁸ de type long. protéine SH a une seule prédit une hélice transmembranaire (TM) domaine ¹⁹ qui est hautement conservée ^20,21. Les domaines de extramembrane C- et N-terminales sont orientées lumenally / extracellulaire et cytoplasmique, respectivement.

Les deux domaines TM synthétique (résidus 18-43) Et pleine longueur de protéine SH ont été représentés pour former homopentamers dans une variété de détergents. La forme homopentameric est responsable de l'activité du canal dans des bicouches lipidiques planes ^22,23. L'orientation correcte des monomères de TM dans la bicouche lipidique a été déterminée en utilisant le site dichroïsme infrarouge spécifique ^23, qui a montré Sa-22 pour être dans un luminal, près de inter-hélicoïdale, l'orientation. Le même domaine TM orientation a été confirmée par des études de RMN qui reconstruit le pentamère un faisceau en hélice de la protéine de pleine longueur dans dodécylphosphocholine (DPC) ²² micelles. Dans ce modèle de «micelles», un seul domaine de TM hélicoïdale a- était flanqué N-terminale par une hélice, et C-terminale par un b-épingle prolongée. Les deux résidus protonables de protéine SH, His-22 et His-51, se trouvent dans le domaine TM (orienté lumenally), et à l'extrémité de la extramembrane β épingle C-terminal (loin du pore du canal), respectivement. Dans un enviro bicellarnement, cependant, la TM α-hélice se étend jusqu'à His-51, et les deux résidus His, sont disponibles à la lumière du canal ^24. Structure de canal adopte une architecture en forme d'entonnoir ^22, où la région étroite (Ser-29 à Cys-45) ²² est revêtu avec des chaînes latérales hydrophobes (Ile-32, Ile-36 Ile-40 et Leu-44), et Ile-36 définit le point le plus étroit dans la lumière du canal. His-22 est située à la plus grande ouverture de cet entonnoir, alors que His-51 est à l'extrémité de la plus petite ouverture.

Dans le présent document, la centrifugation analytique dans un mode de sédimentation à l'équilibre a été utilisée pour déterminer si sa protonation affecte la stabilité de la protéine pentamère SH. Dans ce cas, la protéine SH a été solubilisé dans un détergent C14-bétaïne, qui a été utilisé précédemment pour montrer que les formes de la protéine SH oligomères ²² pentamères.

Protocol

Ce protocole est basé sur les ressources suivantes, qui doivent être visées pour plus de détails et des considérations spéciales 3, 25-28. 1. Densité appariement des micelles de détergent avec 2 H 2 O Remarque: La densité de la solution tampon doit être adaptée à la densité des micelles de détergent. Des agents d'ajustement de densité communs incluent 2 H 2 O, H 2 18 O, …

Representative Results

Le profil radial de distribution de C14SB micelles de détergent dans du Tris 50 mM, NaCl 100 mM pH 7,3, forme un exponentielles très peu profonde qui pourrait être montée sur un modèle linéaire (figure 7A). La pente de cette distribution est inversement corrélée à la concentration de D 2 O (Figure 7B). Le point où la pente est nulle, ce est à dire l'appariement D 2 O concentration, se est révélée être de 32,3%. <p class="jove_content…

Discussion

Ce document fournit un protocole expérimental pour la préparation et l'analyse d'oligomérisation d'une petite protéine membranaire dans un détergent en utilisant l'équilibre sédimentation échantillon. Le protocole décrit est également valable pour simpler- -et protéines solubles, comme l'étape d'adaptation de la densité ne est pas nécessaire. En effet, le système est constitué par un mélange de détergent et de protéines. Pour réaliser des études de sédimentation, le déterge…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate	Sigma	T0807
Deuterium oxide 99.8%	Cambridge Isotope	DLM-4-99.8
An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place	Beckman Coulter	361964
Cell housing	Beckman Coulter	334784
12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled	Beckman Coulter	331376
Window holder	Beckman Coulter	305037
Window gasket	Beckman Coulter	327021
Window liner	Beckman Coulter	362329
Sapphire window	Beckman Coulter	307177
Quartz window	Beckman Coulter	301730
Screw-ring washer	Beckman Coulter	362328
Screw ring	Beckman Coulter	301922
Spinkote	Beckman Coulter	306812
Torque stand assembly	Beckman Coulter	361318
Counterbalance	Beckman Coulter	360219
Cell alignment tool	Beckman Coulter	362340
SEDNTERP			http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis			http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm
SEDPHAT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm