小オリゴマー形成膜タンパク質の沈降平衡：五量体安定性に対するヒスチジンプロトン化の影響
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
分析用超遠心分離（AUC）は、相互作用の強さの広い範囲にわたって、生理的条件下において高分子間の可逆的な相互作用を研究するために使用することができる。これはAUC定量的に化学量論および生化学過程で一過性で可逆的でホモおよびヘテロ会合の熱力学を評価するための最適な方法になります。沈降平衡（SE）のモダリティでは、拡散と沈降の間のバランスは、特定の相関モデルに依存して半径方向距離の関数としてプロファイルを提供しています。本明細書において、詳細なSEプロトコルは、分析用超遠心を用いた小型膜タンパク質のオリゴマーのサイズ及びモノマー – モノマー関連エネルギーを決定するために記載されている。 AUC-ESは、物理的原理に基づいて、無標識であり、そして水溶性及び膜タンパク質の両方で使用することができる。例は後者の表示され、人間の呼吸器合胞体ウイルスの小さな疎水性（SH）タンパク質（はhRSV五量体イオンチャネルを形成する単一のαヘリックス膜貫通（TM）ドメインを持つ）、65アミノ酸のポリペプチド。 NMRベースの構造データは、SHタンパク質がチャネルの内腔に面して配向され、その膜貫通ドメイン二つのプロトン化のHis残基を有することを示している。 SE実験は、pHが会合定数及びSHタンパク質のオリゴマーサイズにどのように影響するかを決定するために設計されています。五量体形態はすべての場合に保存されたが、その結合定数が低いpHで減少した。これらのデータは、SHタンパク質内の2つのHis残基の内腔の向きと一致SHチャネル活性について観察同様のpH依存性と一致している。後者は、静電反発力が発生し、低pHでのオリゴマーの安定性を低減することができる。要約すると、この方法が適用されるたびに、生理学的条件の微妙なタンパク質 – タンパク質会合の変化に関する定量的情報を測定する必要がある。
Introduction
分析超遠心分離1-5は弱いと強い相互作用の両方にアクセス可能であること、生理的条件下での高分子の相互作用を研究するための最も重要な方法の一つである。この方法は、無標識であり、光吸収または干渉を利用し、さらに蛍光光学システムは、大きさが6の数桁にわたって濃度範囲にアクセスするために使用することができる。
ほとんどの生化学的過程が可逆的相互作用に依存するため、この方法は特に便利です。これらの相互作用の化学量論および強度を定量的生物学的プロセスを理解することを特徴とする必要があり、多数の方法が、この目的の7,8のために存在する。しかし、一時的な相互作用は、9を研究することは困難である。
巨大分子の相互作用を特徴付けるための方法の選択は、その静的または動的な性質に依存する。最初のケースでは、sedim entation速度（SV）は、半径方向の輸送速度が測定され、複合体が浮力質量と形状の違いに基づいて分画される場合、使用されている。
対照的に、実験の時間スケールで可逆的で動的な関連付けは、物理的に分離することができない。この場合には、自己または非共有結合性相互作用をもたらすヘテロ相互作用は、総タンパク質濃度に依存して平衡状態にある。これらの動的な相互作用は、沈降平衡（SE）及び沈降速度（SV）10の両方で研究することができる。しかし、第一の方法は、実行するために簡単であり、ここで説明されている。平衡拡散沈降の間に到達するようにSEでは、遠心分離が十分に低速で行われる。この時点で、半径方向距離の関数としての光信号（UV-VIS）の平衡プロファイルは、アソシエーション11用に事前設定された熱力学モデルを用いて分析することができる。
ve_content ">本研究では、沈降平衡試験があるため、その疎水性のイオンチャネルを形成し、ウイルス膜タンパク質の自己会合が示されているが、実験は、界面活性剤の存在下で実行され、この場合の密度のさ溶媒は、界面活性剤のそれに一致させる必要があるが、記載されるプロトコルは、水溶性タンパク質の場合には同一の場合と、無溶媒濃度マッチングを必要としないであろうことを除いて。使用されるタンパク質は、世界中のヒト呼吸器合胞体ウイルス（はhRSV）、乳児の下気道疾患の原因となるパラミクソウイルス科に包まニューモ、高齢者や免疫不全の集団12でエンコードされます。最大6400万はhRSV感染16万人の死亡の症例が毎年発生すると報告した。
はhRSVゲノム三膜タンパク質F、G、及び小さな疎水性（SH）を含む11のタンパク質を転写する。 SHタンパク質が関与しているRSV感染の病因に。 SH遺伝子（RSVΔSH）を欠くRSVは、生存可能であったシンシチウムの形成を引き起こし、野生型（WT）ウイルス13-16と同様に増殖した。しかし、RSVΔSHウイルスは上気道15、16にWTよりも低い効率で10倍に複製。また、RSVΔSHウイルスはin vivoでのマウスとチンパンジーモデル13、17で減衰されました。
SHタンパク質は、主にゴルジコン パートメント18の膜64に蓄積する（RSVサブグループA）または65（RSVサブグループB）アミノ酸長いII型内在性膜タンパク質である。 SHタンパク質は高度に保存されている20,21を単一の予測ヘリックス膜貫通（TM）ドメイン19を有している。 C-およびN-末端膜外ドメインは、それぞれ、内腔に/細胞外及び細胞質に配向されている。
両方の合成TMドメイン（残基18-43）及び全長SHタンパク質は、界面活性剤の様々なhomopentamersを形成することが示されている。ホモ五量体の形は、平面脂質二重層22,23におけるチャネル活性を担当しています。脂質二重層におけるTMモノマーの正しい配向は、第1のインターらせん配向に近い内腔であることのHis-22を示した部位特異的な赤外線二色23を使用して決定した。同一のTMドメイン配向は、ドデシルホスホコリンにおける全長タンパク質の五量ヘリックスバンドル（DPC）が22をミセルが再構成されたNMR研究により確認された。この「ミセル」モデルでは、単一のA-らせんTMドメインは、拡張B-ヘアピンによってC末端AヘリックスによってN末端が隣接し、そしてた。 SHタンパク質の2つのプロトン化可能な残基のHis-22およびHis-51、TMドメイン（内腔に配向）に配置され、膜外C末端βヘアピンの先端のそれぞれ、（遠チャンネル孔から）。バイセルエンバイロでnmentは、しかし、TMのαヘリックスは、彼の-51にまで延びており、両方のHis残基は、チャンネル24の内腔にアクセス可能である。チャネル構造は、（のCys-45へのSer-29）狭い地域漏斗のようなアーキテクチャ22は、22は疎水性側鎖（イル·32、イル= 36、イル= 40およびLeu-44）が並んで採用しており、イル·36は、チャンネル内腔に狭いポイントを定義します。のHis-51が最も小さい開口部の先端部に、一方のHis-22は、このファンネルの最大の開口部に配置されている。
本論文では、沈降平衡モードでの分析の遠心分離は、Hisプロトン化は、SHタンパク質五量の安定性に影響を与えるかどうかを決定するために使用されてきた。この場合、SHタンパク質は、そのSHタンパク質の形態五量体オリゴマー22を表示するために以前に使用されているC14-ベタイン界面活性剤で可溶化した。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、平衡沈降を使用して、洗剤の小さな膜タンパク質のオリゴマー化の試料調製および分析のための実験プロトコルを提供します。密度マッチングステップが必要とされないように記載されるプロトコルは、可溶性タンパク質に同等に有効で-and simpler-ある。実際に、システムは、界面活性剤とタンパク質との混合物で構成されている。それは、粒子浮選に寄与しないように、沈降研…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
Referências
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. . Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions – Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- . . An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. . Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
