La sedimentación de equilibrio de una proteína de membrana pequeña formador de oligómeros: Efecto de la histidina protonación en pentamérica Estabilidad

Summary

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Abstract

Ultracentrifugación analítica (AUC) se puede utilizar para estudiar las interacciones reversibles entre macromoléculas a través de una amplia gama de fuerzas de interacción y bajo condiciones fisiológicas. Esto hace AUC un método de elección para evaluar cuantitativamente la estequiometría y la termodinámica de homo- y hetero-asociación que son transitorios y reversibles en los procesos bioquímicos. En la modalidad de equilibrio de sedimentación (SE), un equilibrio entre la difusión y sedimentación proporciona un perfil como una función de la distancia radial que depende de un modelo de asociación específica. En la presente memoria, un protocolo detallado SE se describe para determinar el tamaño y el monómero-monómero asociación de energía de un pequeño oligómero proteína de la membrana utilizando una ultracentrífuga analítica. AUC-ES es libre de etiquetas, solamente basado en principios físicos, y se puede utilizar en ambas proteínas solubles y de membrana de agua. Se muestra un ejemplo de este último, la proteína hidrófoba pequeña (SH) en el virus sincitial respiratorio humano (VRSh), Un polipéptido de ácido 65-amino con una sola transmembrana (TM) de dominio α-helicoidal que forma canales iónicos pentaméricas. Datos estructurales a base de RMN muestra que la proteína SH tiene dos protonable residuos de His en su dominio transmembrana que están orientados dirigida a la luz de la canal. SE experimentos han sido diseñados para determinar cómo afecta a pH constante de asociación y el tamaño oligomérico de la proteína SH. Mientras que la forma pentamérica se conservó en todos los casos, su constante asociación se redujo a pH bajo. Estos datos están de acuerdo con una dependencia del pH similares observados para la actividad del canal SH, en consonancia con una orientación lumenal de los dos residuos de His en la proteína SH. Este último puede experimentar la repulsión electrostática y la reducción de la estabilidad oligómero a pH bajo. En resumen, este método es aplicable siempre que la información cuantitativa sobre los cambios de asociación entre proteínas sutiles en condiciones fisiológicas tiene que medir.

Introduction

Ultracentrifugación analítica ^1-5 es uno de los métodos más importantes para estudiar las interacciones de macromoléculas en condiciones fisiológicas, siendo accesible tanto a interacciones débiles y fuertes. El método es libre de etiquetas y utiliza la absorción de luz o interferencia, e incluso los sistemas ópticos de fluorescencia se puede utilizar para acceder a los intervalos de concentración en varios órdenes de magnitud ^6.

Este método es especialmente útil ya que la mayoría de los procesos bioquímicos dependen de las interacciones reversibles. La estequiometría y la fuerza de estas interacciones tienen que caracterizarse cuantitativamente a entender los procesos biológicos, y un número de métodos existen para este propósito ^{7, 8.} Sin embargo, las interacciones transitorias son difíciles de estudiar ^9.

La elección de un método para caracterizar las interacciones macromoleculares depende de su naturaleza estática o dinámica. En el primer caso, Sedim se utiliza la velocidad entación (SV), donde se mide la tasa de transporte radial y complejos se fraccionó sobre la base de diferencias en la masa flotante y forma.

En contraste, las asociaciones dinámicas que son reversibles en la escala de tiempo del experimento no se pueden separar físicamente. En este caso, auto o hetero-interacciones que conducen a interacciones no covalentes están en un equilibrio que depende de la concentración de proteína total. Estas interacciones dinámicas pueden ser estudiados tanto por equilibrio de sedimentación (SE) y la velocidad de sedimentación (SV) ^10. Sin embargo, el primer método es más simple de realizar y se describe aquí. En SE, la centrifugación se realiza a una velocidad suficientemente baja para que se alcanza un equilibrio entre la difusión y sedimentación. En este punto, el perfil de equilibrio de una señal óptica (UV-VIS) como una función de la distancia radial, se puede analizar utilizando modelos termodinámicos pre-establecido para asociaciones ^11.

ve_content "> En el presente trabajo, un estudio de equilibrio de sedimentación se presenta de la auto-asociación de una proteína de la membrana viral que forma canales iónicos. Debido a su hidrofobicidad, el experimento se ejecuta en presencia de detergente, y en este caso la densidad de disolvente tiene que ser adaptada a la del detergente. Sin embargo, el protocolo descrito sería idéntica en el caso de una proteína soluble en agua, excepto que se requeriría sin concordancia de densidad de disolvente.

La proteína utilizada está codificada en el virus respiratorio sincitial humano (VRSh), un neumovirus envuelto en la familia Paramyxoviridae que causa la enfermedad de vías respiratorias bajas en los lactantes, los ancianos y las poblaciones inmunocomprometidas en todo el mundo ^12. Hasta 64 millones de casos notificados de infección VRSh y 160.000 muertes ocurren cada año.

El genoma VRSh transcribe 11 proteínas, incluyendo las tres proteínas de la membrana f, g, y una pequeña hidrófoba (SH). Proteína SH está involucradoen la patogénesis de la infección por RSV. RSV carece del gen SH (RSVΔSH) era viable, causó la formación de sincitios y creció así como la de tipo salvaje (WT) virus ^13-16. Sin embargo, el virus de RSVΔSH replicado 10 veces menos eficiente que la WT en el tracto respiratorio superior ^{15, 16.} Además, el virus RSVΔSH fue atenuada en vivo en el ratón y modelos de chimpancés ^{13, 17.}

La proteína SH es un (RSV subgrupo A) 64 o 65 (RSV subgrupo B) aminoácidos de longitud tipo II proteína integral de membrana que se acumula principalmente en las membranas de Golgi el compartimiento ^18. Proteína SH tiene un solo predijo una hélice transmembrana (TM) de dominio ¹⁹ que está altamente conservada ^20,21. Los dominios extramembrane C- y N-terminales están orientados lumenally / extracelularmente y el citoplasma, respectivamente.

Tanto dominio sintético TM (residuos 18-43) Y la proteína SH de longitud completa se ha demostrado para formar homopentamers en una variedad de detergentes. La forma homopentamérica es responsable de la actividad del canal en bicapas lipídicas planas ^22,23. La orientación correcta de los monómeros TM en la bicapa lipídica se determinó primero utilizando sitio dicroísmo infrarrojos específica ^23, que mostró su-22 para estar en un luminal, cerca de inter-helicoidal, orientación. La misma orientación dominio TM fue confirmada por estudios de RMN que reconstruyen la pentamérica a-helicoidal paquete de la proteína de longitud completa en dodecylphosphocholine (DPC) micelas ^22. En este modelo de "micelas", un dominio TM helicoidal a- solo estaba flanqueado N-terminal por una a-hélice, y C-terminal por un b-horquilla extendida. Los dos residuos protonables de proteína SH, Su-22 y Su-51, se encuentran en el dominio TM (orientado lumenally), y en la punta de la extramembrane C-terminal de β horquilla (lejos del poro del canal), respectivamente. En un enviro bicellarnment, sin embargo, el TM α-hélice se extiende hasta Su-51, y los dos residuos de His son accesibles para el lumen del canal ^24. La estructura de canal adopta una arquitectura similar a un embudo ^22, en donde la región más estrecha (Ser-Cys-29 a 45) ²² se alinea con cadenas laterales hidrófobas (ILE-32, Ile-36, Ile-40 y Leu-44), y Ile-36 define el punto más estrecho en el lumen del canal. Su-22 se encuentra en la mayor apertura de este embudo, mientras que su-51 está en la punta de la abertura más pequeña.

En el presente trabajo, centrifugación analítica en un modo de equilibrio de sedimentación se ha utilizado para determinar si su protonación afecta a la estabilidad de la proteína SH pentámero. En este caso, la proteína SH fue solubilizado en detergente C14-betaína, que se ha utilizado previamente para mostrar que las formas de la proteína SH oligómeros pentaméricas ^22.

Protocol

Este protocolo se basa en los siguientes recursos, que han de ser remitidos para más detalles y consideraciones especiales 3, 25-28. 1. Densidad juego de micelas de detergente con 2 H 2 O Nota: La densidad de la solución tampón debe ser adaptada a la densidad de las micelas de detergente. Agentes de ajuste de densidad comunes incluyen 2 H 2 O, H 2 18 O, 2 H 2 O <su…

Representative Results

El perfil radial de distribución de micelas de detergente C14SB en Tris 50 mM, NaCl 100 mM pH 7,3 formas exponenciales una muy superficial que podría ser instalado en un modelo lineal (Figura 7A). La pendiente de esta distribución está inversamente correlacionada con la concentración de D 2 O (Figura 7B). El punto donde la pendiente es cero, es decir, la correspondencia D 2 O concentración, se encontró que era 32,3%. Ver…

Discussion

Este documento proporciona un protocolo experimental para la preparación y análisis de oligomerización de una pequeña proteína de membrana en detergente utilizando sedimentación equilibrio muestra. El protocolo descrito es igualmente válido -y simpler- para las proteínas solubles, como no se requiere la etapa de adaptación de la densidad. De hecho, el sistema está constituido por una mezcla de detergente y proteína. Para llevar a cabo estudios de sedimentación, el detergente debe ser invisible al campo gravi…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate	Sigma	T0807
Deuterium oxide 99.8%	Cambridge Isotope	DLM-4-99.8
An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place	Beckman Coulter	361964
Cell housing	Beckman Coulter	334784
12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled	Beckman Coulter	331376
Window holder	Beckman Coulter	305037
Window gasket	Beckman Coulter	327021
Window liner	Beckman Coulter	362329
Sapphire window	Beckman Coulter	307177
Quartz window	Beckman Coulter	301730
Screw-ring washer	Beckman Coulter	362328
Screw ring	Beckman Coulter	301922
Spinkote	Beckman Coulter	306812
Torque stand assembly	Beckman Coulter	361318
Counterbalance	Beckman Coulter	360219
Cell alignment tool	Beckman Coulter	362340
SEDNTERP			http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis			http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm
SEDPHAT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm