A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.
Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.
I de seneste år har vores forståelse af neuron og neuronal kredsløbsfunktion blevet revolutioneret af flere optogenetic værktøjer, der styrer neuronal excitabilitet. Et af midlerne hertil er lysaktiveret kation kanal, channelrhodopsin-2 (CHR2): neuroner udtrykker CHR2 brand aktionspotentialer som reaktion på lys stimulation 1-3. Fordi neuroner er normalt ikke følsomme over for lys, denne bemærkelsesværdige evne åbner nye muligheder for den præcise tidsmæssige og rumlige styring af aktiviteten af genetisk definerede populationer af neuroner 4 og har i høj grad accelereret studier af hjernens funktion. CHR2 er blevet anvendt på stamcelleforskning til forskellige formål, fra overvågning neuronal udvikling 5 til at regulere aktiviteten af neurale netværk 6.
Her anvendte vi CHR2 at øge anvendeligheden af en neuronal co-dyrkningssystem. Co-kultur systemer gør det muligt at vurdere samspillet mellem forskellige celletyper.Co-kulturer af neuroner og glia, de vigtigste celletyper i nervesystemet, er almindeligt anvendt til at undersøge signalering mellem disse forskellige celletyper, samt at vurdere betydningen af denne signalering for fysiologiske reaktioner, spredning af skader og til at undersøge molekylære mekanismer, der potentielt er involveret i denne signalering 7. En tidligere undersøgelse har vist, at humane iPSCs differentiere meget hurtigt til neuroner i nærvær af rotte corticale primær kultur indeholdende neuroner, astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia 8.
I denne protokol, viser vi en metode, der udnytter CHR2 i en co-kultur for at afhøre synaptiske forbindelser mellem rotte corticale neuroner og neuroner fra humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Vi beskriver skridt til at dissekere og høst hjernevæv 9 samt at vedligeholde og differentiere mus neurale stamceller (NPCs) i astrocytter og menneskelige NPCs into neuroner at skabe co-kultur-systemet. For at etablere dette samarbejde dyrkningssystem, vi brugte den beskrevet af Okita et al integration uden omprogrammering metode. 10 til at generere humane iPSCs. Disse iPSCs blev derefter effektivt differentieret i NPC'ere i kemisk definerede betingelser ved brug små molekyler inhibitorer som beskrevet af Li et al. 11
I co-kulturer, kan identificeres af de forskellige populationer af neuroner via påvisning af CHR2 ekspression i corticale neuroner og tagging af iPSC-afledte neuroner via fluorescerende protein, tandem-dimer Tomat (tdTomato). Kombination elektrofysiologiske optagelser fra iPSC-afledte neuroner med optogenetic photostimulation af kortikale neuroner muligt at vurdere evnen af disse to typer af neuroner til at danne kredsløb med hinanden. Specifikt photostimulation af CHR2-udtrykkende kortikale neuroner fremkalde synaptiske reaktioner i iPSC-afledte neuroner, der har dannet synaptiske kredsløbmed photostimulated cortical neuron netværk. Vi viser, at øget postsynaptiske strømme faktisk opdages i iPSC-afledte neuroner under sådanne forhold. Denne protokol tillader vurdering af synaptisk kredsløb under en række eksperimentelle betingelser, herunder sammenfatning af forskellige neurologiske sygdomsmodeller ved hjælp iPSCs afledt fra fibroblaster fra patienter sygdom.
Optogenetics giver tidsmæssig og rumlig præcision for aktivering af definerede populationer af neuroner 13. I vores forsøg blev hele området for mikroskopobjektivet belyst i 30 sek til foto-stimulere kun kortikale neuroner udtrykker CHR2. Dette tillod os at bestemme, om synaptiske forbindelser blev dannet mellem forskellige populationer af neuroner i co-kultur. Vores resultater viste, at photostimulation øger PSC frekvens i iPSC-afledte neuroner, der viser, at disse neuroner modtager synaptisk input fra præsynaptiske corticale neuroner udtrykker CHR2. Dette, til gengæld fast, at IPSC-afledte neuroner held indarbejdet i kredsløb med de kortikale neuroner.
Der er flere kritiske trin til generering af denne co-kultur-systemet. Det er vigtigt at sikre, at de muse NPC-afledte astrocytkulturer er sunde, med minimal celledød, inden der fortsættes med pletteringaf andre celletyper. Corticalneuroner og menneskelige NPCs vedhæfte godt på sunde astrocytter og elektrofysiologiske optagelser er stærkt afhængige af dyrkningsbetingelser. De andre vigtige skridt i denne protokol er det elektroporation og plettering af kortikale neuroner på astrocytkulturer. Da et stort antal af celler dør efter elektroporering, er det vigtigt at sikre, at mindst 6 millioner kortikale neuroner er elektroporeret for udpladning på astrocytkulturer i 24-brønds plader. Vi har observeret, at når færre end 6 millioner celler blev elektroporeret, havde antallet af neuroner, der overlever ikke danner en tæt neuronal netværk, hvilket påvirkede elektrofysiologiske optagelser. Antallet af elektroporerede kortikale neuroner bør også være i overensstemmelse for hver co-kultur eksperiment for at muliggøre sammenligning mellem forskellige studier. For alle trin, der involverer enzymatisk fordøjelse, er det vigtigt ikke at lade celler i fordøjelsessystemet løsning for længe, da det kan føre til celledød.
Dettefremgangsmåde kan anvendes til at screene evnen af neuroner afledt fra patient-specifikke fibroblaster til dannelse synaptiske kontakter med andre neuroner. Neuroner afledt fra fibroblaster fra patienter, der lider af neurologisk lidelse Rett Syndrome (RTT) udviser synaptisk transmission fejl: RTT neuroner udviser et signifikant fald i PSC frekvens og amplitude sammenlignet med raske neuroner, formodentlig på grund af mindre synaptisk forbindelse 14. Vores co-kultur system tillader undersøgelse af effekter narkotika på neuroner udviser udviklingsmæssige defekter. Dette kan udføres ved tilsætning af forbindelser af interesse under såning af syge humane NPC samt under kontinuerlig eksponering til forbindelser hele tiden af neuronal differentiering.
Mens dette co-kultursystem kan også anvendes som en model for test af lægemidler, en begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at processen med at undersøge virkningerne af hver kandidat forbindelse kan være lang og kedelig somdet er ikke en high-throughput screening-metode. Efter behandling med kandidatforbindelser, iPSC-afledte neuroner skal være individuelt lappet at bestemme virkningerne af hver forbindelse på kvikskranker. Desuden er der i øjeblikket ikke mange tilgængelige fibroblaster og iPSCs fra patienter. Derfor vil det være af interesse i den nærmeste fremtid for at få mere tålmodig celler og også for at tilpasse denne protokol til high throughput screening. For eksempel ved mærkning iPSC-afledte neuroner med en indikator, såsom genetisk kodede sensorer ioner eller membranpotentiale, ville det være muligt i væsentlig grad at øge gennemløb rente med side-stepping tidskrævende elektrofysiologiske procedure. Da hele processen med at generere denne co-kultur-systemet, fra omprogrammering fibroblaster til at udføre elektrofysiologiske optagelser, kræver mere end 90 dage, anbefales det, at enten de menneskelige iPSCs eller NPC'ere udvides efter omprogrammering og neurale induktion skridt henholdsvisog kryokonserveret at reducere den nødvendige tid for fremtidige eksperimenter.
I vores eksperimenter, vi udtrykte CHR2 i corticale neuroner under synapsin1 promotoren. Fordi denne promotor er pan-neuronal vi formentlig blev photostimulating både inhiberende og excitatoriske corticale neuroner. Hvis målet for fremtidige eksperimenter er specifikt afhøre enten hæmmende eller excitatoriske kredsløb, kunne mere specifikke promotorer anvendes. Alternativt kunne kortikale neuroner opnås fra transgene (eller virus-injicerede mus) hvor CHR2 udtryk er specifikt målrettet til genetisk definerede subpopulationer af neuroner. For eksempel høst corticale væv fra en mus, der har Cre-rekombinase udtrykt i parvalbumin indeholdende interneuroner (PV interneuroner), der krydses med en mus med floxed CHR2 vil give en situation, hvor de eneste corticale neuroner udtrykker CHR2 bliver PV interneuroner 15. Anvendelsen af sådanne CHR2-udtrykkende interneuroner i vores co-culture systemet vil gøre det muligt at fastslå, om en lappet iPSC-afledt neuron er i stand til at indarbejde i et kredsløb med PV interneuroner.
Baseret på en tidligere undersøgelse 9 kortikale neuroner er modne med overlappende dendritter efter 14 dage in vitro. Således, hvis photostimulation ikke fremkalder en reaktion fra en patched iPSC-afledt neuron, bør det indikere, at neuron ikke har evnen til at gøre synaptiske forbindelser med corticale neuroner. En iPSC afledt neuron er i stand til at modtage synaptisk input fra enten andre iPSC-afledte neuroner eller corticale neuroner. Hvis der blev anvendt traditionelle patch clamp optagelser, ville det ikke være muligt at skelne, hvor synaptiske input kommer fra. Fordelen ved vores system er, at postsynaptiske svar fra kortikal præsynaptiske indgang kan selektivt fremkaldte og identificeret. Procedurerne her tilvejebringe en enkel fremgangsmåde til at evaluere evnen til iPSC-afledte neuroner til at integrerei et afgrænset neuronal netværk.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker K. Deisseroth og S. Je for CHR2 og Synapsin1-tdTomato lentivirale konstruktioner henholdsvis C. Chai til deling ekspertise og protokol om iPSC generation, WY Leong for teknisk support, medlemmer af Goh laboratorium for deling reagenser og ekspertise. Dette arbejde blev støttet af Abbott Ernæring og Akademisk Centre of Excellence (ACE) forskningspris fra GlaxoSmithKline (GSK) til ELG, af National Research Foundation Singapore under sin konkurrencemæssige Research Program (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) til ELG og GJA, og af World Class Institute (WCI) Program for National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for undervisning, videnskab og teknologi Korea (MEST) (NRF Grant Nummer: WCI 2009-003) til GJA
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | |
Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
EGF | Merck Millipore | 324856 | |
FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
Papain | Worthington | 3126 | |
HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
CaCl2 | Sigma | C1016 | |
D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
K-gluconate | Sigma | P1847 | |
KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Na2ATP | Sigma | A7699 | |
Na3GTP | Sigma | G8877 | |
Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
24-well plates | Corning | 9761146 | |
6-well plates | Corning | 720083 | |
T25 flasks | Corning | 430641 | |
12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 | |