<em> В Ово</em> Хорионалантоисной Мембрана (САМ) Анализ как эффективный ксенотрансплантата модели гепатоцеллюлярной карциномы
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
Хорионалантоисной мембрана (CAM) начинает развиваться на 7 день после оплодотворения и созревает день 12. САМ естественно иммунодефицитом и высокой васкуляризации, что делает его идеальной системой для имплантации опухоли. Кроме того, CAM содержит белки внеклеточного матрикса, таких как фибронектин, ламинин, коллаген, интегринового альфа (v) Beta3 и ММР-2, что делает его привлекательным модель для изучения опухолевой инвазии и метастазированию. Ученые давно воспользовались физиологии CAM, используя его в качестве модели ангиогенеза. Совсем недавно, САМ-анализ был изменен, чтобы работать, как в естественных условиях ксенотрансплантанта модельной системы для различных видов рака, что устраняет разрыв между основной работой в пробирке и более сложных моделях рака животное. Анализе САМ позволяет для изучения роста опухоли, противоопухолевых терапий, и про-опухолевых молекулярных путей в биологически соответствующей системы, которая одновременно экономически и время эффективным. Здесь мы опишем развитие CAM Xenograft модель гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) с эмбриональными выживаемости до 93% и надежной опухоли занимают ведущие к росту трехмерных, васкуляризированных опухолей.
Introduction
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является 3-й ведущей причиной смертности от рака в мире 1. В настоящее время только 30% пациентов с ГЦК из имеют право на потенциально лечебных хирургических методов лечения 2 и системная химиотерапия не эффективна 3. Таким образом, существует настоятельная неудовлетворенная клиническая необходимость в новых ГЦК терапии, и развитие модельных систем, пригодных для эффективного тестирования новых агентов. Хорионалантоисной мембрана (CAM) анализ обеспечивает воспроизводимое, экономически эффективной, и быстрый метод средней пропускной тестирования потенциальных лекарств против опухолевых в естественных условиях.
САМ тест широко используется для изучения ангиогенеза 4. Это также успешно превратилась в модели ксенотрансплантата опухоли раковых заболеваний, в том числе глиобластомы 5, рак поджелудочной железы, меланомы 6 7-9 и 10-11 остеосаркомы. И в яйце 12 и экс ово13 методы были использованы в литературе, с деталями из различных протокола для протокола. Одна из основных задач в модели CAM ксенотрансплантанта является относительно высокий уровень эмбриональной смерти после манипуляций с яйцом, с опубликованным тарифам куриных эмбрионов смертности, начиная от 25 – 50 процентов 11-14.
В этой статье мы опишем разработку ин ово модели ксенотрансплантата ГЦК, которые надежно производит рост трехмерных, васкуляризированных опухолей, которые гистологически напоминают недифференцированные HCC. Мы адаптировали протокол, впервые описанного Ossowski соавт. 14 и добились куриных эмбриональных выживаемости до 93% с чрезвычайно высокой приживления опухоли.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько ключевых шагов в этом протоколе, скорее всего, приходится улучшенной эмбрионального выживания, а также повышенной надежностью роста опухоли. Падение CAM от оболочки путем применения всасывания воздуха мешка менее агрессивна, чем другие существующие методы (с помощью иглы для…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
Referências
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma–an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
