الكمي للمناعة tacrolimus على وبقع الدم الجافة عن طريق LC-MS / MS
Summary
Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
Abstract
وتاكروليموس الكالسينيورين المانع هو حجر الزاوية في معظم بروتوكولات العلاج المثبطة للمناعة بعد زرع الأعضاء الصلبة في الولايات المتحدة. تاكروليماس هو ضيق مؤشر المخدرات العلاجية ومثل يتطلب مراقبة الأدوية العلاجية وتعديل الجرعة بناء على تركيزات كلها في الحوض الصغير الدم. لتسهيل المخدرات العلاجية الداخل ومراقبة الالتزام، وجمع من بقع الدم المجفف هو مفهوم جذابا. بعد عصا إصبع، والمريض بجمع قطرة دم على ورق الترشيح في المنزل. بعد تجفيفها الدم، وإرساله إلى المختبر التحليلي حيث كميا تاكروليماس باستخدام السائل عالي الأداء اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (HPLC-MS / MS) في توليفة مع يدوية بسيطة من البروتين هطول خطوة واستخراج العمود الانترنت.
لتحليل تاكروليماس، واللكم 6 ملم القرص من مركز المشبعة من بقعة الدم. والمتجانس بقعة الدم باستخدام رصاصة خلاط لالثانية ثم يتم عجلت البروتينات مع الميثانول / 0.2 M ZnSO 4 التي تحتوي على مستوى D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس. بعد vortexing لوالطرد المركزي، ويتم حقن 100 ميكرولتر من طاف في عمود استخراج الانترنت وغسلها مع 5 مل / دقيقة 0.1 الفورميك حمض / الأسيتونتريل (7: 3، ت: ت) لمدة 1 دقيقة. الآخرة، يتم تنشيط صمام التحويل وتحليلها يتم مسح الظهر على العمود التحليلي (وفصلها باستخدام 0.1٪ حمض الفورميك / الأسيتونتريل التدرج). وكميا تاكروليماس في وضع إيجابي متعدد رد فعل (MRM) باستخدام مطياف الكتلة جنبا إلى جنب.
فحص خطي 1-50 نانوغرام / مل. التباين بين فحص (3.6٪ -6.1٪) والدقة (91.7٪ -101.6٪) وفقا لتقييم أكثر من 20 أيام تلبية معايير القبول. متوسط الانتعاش الاستخراج 95.5٪. لا توجد صلة المرحل، التدخلات المصفوفة والآثار المصفوفة. تاكروليماس مستقر في بقع الدم الجافة في RT وفي +4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع. العينات المستخرجة فيالاوتوماتيكى مستقرة في +4 درجة مئوية لمدة 72 ساعة على الأقل.
Introduction
تاكروليماس هو immonosuppressant قوية 7/1 التي لديها بنية ماكروليد 8 (الشكل 1). نظرا لرابطة الدول المستقلة – تصاوغ العابر للسندات CN أنها تشكل اثنين rotamers في حل 9 التي يمكن أن تكون مفصولة مرحلة عكس الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) التاكروليموس هو محبة للدهون وقابل للذوبان في الكحول (الميثانول: 653 غرام / لتر، والإيثانول: 355 ز / L)، والهيدروكربونات الهالوجينية (كلوروفورم: 573 غرام / لتر) والأثير. وهو قابل للذوبان لماما في الهيدروكربونات الأليفاتية (الهكسان: 0.1 جرام / لتر والمياه (درجة الحموضة 3: 0.0047 جم / L) 9 لا يحتوي جزيء أي حامل اللون والحد الأقصى للأشعة فوق البنفسجية امتصاصه هو 192 نانومتر التاكروليموس الأعمال عن طريق تثبيط الكالسينيورين. وقد تم استعراض آلية العمل في المراجع 10،11. ويستخدم حاليا في أكثر من 80٪ من مرضى زرع الأعضاء الصلبة، في الولايات المتحدة 12.
المؤشر العلاجي للتاكروليماس هو considereد أن يكون ضيقا 13. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العلاقة بين الجرعات تاكروليماس وتركيزات الدم ضعيف والدوائية هو متغير 14،15. مراقبة الأدوية العلاجية لتوجيه تاكروليماس الجرعات في مرضى زرع هو الممارسة السريرية ولالعامة 16-20. الهدف هو الحفاظ على تركيزات تاكروليماس الدم ضمن نطاق العلاجية المحددة مسبقا. تركيزات تاكروليماس الدم أقل من المستوى العلاجي قد يؤدي إلى زيادة نشاط التفاعلات ألو المناعة المزمنة أو الحادة، بينما تركيزات أعلى من النافذة العلاجية تزيد من خطر الإفراط في كبت المناعة والسرطان والسميات، مثل الكلوي، العصبية، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري. عالية التباين داخل الفرد الدوائية التاكروليموس قد يكون ضارا لكلا زرع الأعضاء وبقاء المريض 21،22. في حين تقلب بين الفردية الدوائية تاكروليماس تسببه أساسا الأشكال CYP3A5، أسباب داخل الفردتقلب تشمل، ولكنها لا تقتصر على، المخدرات المخدرات، والمرض للعقاقير والمخدرات التفاعلات الغذاء 14،15. تفتقر أيضا الانضمام إلى مناعة العلاجية نظام المخدرات هو أحد العوامل المساهمة والسبب الرئيسي لفقدان الكسب غير المشروع 23،24.
وتشير هذه الاعتبارات أن المخدرات العلاجية المنزل المتكرر ومراقبة التزام تاكروليماس تركيزات الدم كله قد يكون مفيدا للتأكد من أن المرضى الذين لديهم التعرض تاكروليماس ضمن إطار العلاجي المطلوب في جميع الأوقات. ومع ذلك، والخدمات اللوجستية وتكلفة أكثر تواترا مراقبة الأدوية العلاجية كما هو الممارسة السريرية الحالية 15 باهظة. أحد الأسباب هو أن المريض لديه لمعرفة فصاد أن يكون عينة من الدم الوريدي المطلوب استخلاصها. وقد ظهرت مؤخرا بقع الدم الجافة كمفهوم جذابة 25-28. بعد إصبع بسيطة عصا المريض بجمع قطرة دم على ورقة ورقة فلتر خاصة وبعد أن د بقعة الدمرييد، فإنه يمكن أن ترسل إلى المختبر المركزي لتحليل تاكروليماس وأي مناعة أخرى أن المريض قد تكون آخذة في الوقت الراهن. وقد أصبح هذا ممكنا بفضل تطور فحوصات LC-MS / MS حساسة للغاية ومحددة لتقدير حجم تاكروليماس ومناعة أخرى في حجم الدموية الصغيرة جدا مثل بقع الدم المجفف (عادة 20 ميكرولتر من الدم) 25،29-43. ميزة أخرى هي أنه، استراتيجيات جمع الغازية الحد الأدنى منخفضة عينة حجم مثل بقع الدم المجفف يسهل إلى حد كبير مراقبة الأدوية العلاجية والدراسات الدوائية في الأطفال الصغار 28.
وعادة ما تقاس تاكروليماس في EDTA وريدي كله الدم 15. الأسباب التي تاكروليماس يوزع على نطاق واسع في خلايا الدم وأن الدراسات السريرية وأفادت علاقة أفضل بين تركيزات تاكروليماس الحوض الصغير في الدم من البلازما في الأحداث السريرية 15،18. في المقارنة، وتحليل تاويستند crolimus في بقع الدم المجفف على الدم الشعرية التي يختلط مع مصفوفة ورق الترشيح. هذه تحديات من حيث الإذابة التاكروليموس والتدخلات المحتملة مع تحليل LC-MS / MS. هنا نقدم مقايسة إنشاء والتحقق من صحتها على أساس تجانس بقعة الدم المجفف باستخدام خلاط رصاصة في توليفة مع ارتفاع تدفق عينة العمود الانترنت تنظيف الداخلي وتحليل LC-MS / MS. اعتبارا من اليوم، وقد تم بنجاح استخدام هذا الاختبار لتقدير حجم أكثر من خمسة آلاف تاكروليماس المجففة عينات بقعة الدم لرصد الالتزام في التجارب السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم، كما سبق ذكره، فإن مفهوم المخدرات العلاجية ومراقبة التزام تاكروليماس بناء على بقع الدم المجفف جذابة، هناك تحديات التحليلية التي تتجاوز تلك التي ترتبط عادة مع تحليل LC-MS / MS التاكروليموس في EDTA وريدي عينات الدم الكامل. وتشمل هذه، ولكن ليس على سبيل الحصر، أن ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.
Materials
| Reference Materials | ||
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 |
| Test Materials | ||
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q |
| Solvents | ||
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9 % | Sigma-Aldrich | 439126-4 L |
| Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 |
| Isopropanol 99.9 %, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 |
| Methanol Optima LC/ MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 |
| Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 |
| Other Chemicals | ||
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 |
| Laboratory Instruments and Consumables | ||
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 |
| 1,5 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 |
| 10 – 100 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 |
| 10 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 |
| 100 – 1000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 |
| 100 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 |
| 1000 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 |
| 2 – 20 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 |
| 2 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 |
| 20 – 200 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 |
| 20 μL- pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 |
| 200 μL- pipet tips with filter | Multimax | 2938T |
| 200 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J |
| 50 mL- Falcon tube | BD Falcon | 352070 |
| 300 μL inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 |
| Glass v ials, 4 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 |
| Glass vials, 20 mL | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S |
| HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B |
| Needle, 18G 1.5 | Precision Glide | 305196 |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 |
| HPLC Equipment and Columns | ||
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 |
| Tandem Mass Spectrometer | ||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
Referências
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
- Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
- . Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
- . A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
- Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
- Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group.. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
- Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
- Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
- Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
- Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
- Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
- Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L., Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. e. b. b. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. , 529-562 (2005).
- Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
- Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
- Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
- Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
- Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
- Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
- Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
- Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
- Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
- Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
- Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
- Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
- Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
- Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
- Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
- Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
- Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
- Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
- Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
- Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
- Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
- Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
- Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
- Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
- Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
- Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
- Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
- Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
- Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
- Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
- Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).
