Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS
Summary
Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
Abstract
Die Calcineurin-Inhibitor Tacrolimus ist der Eckpfeiler der meisten immunsuppressiven Behandlungsprotokolle nach Organtransplantation in den Vereinigten Staaten. Tacrolimus ist eine geringe therapeutische Droge und als solche erfordert therapeutischen Drug-Monitoring und Dosisanpassung basierend auf seiner Vollblut-Talspiegel. Nach Hause zu therapeutischen Drug-Monitoring und die Einhaltung zu erleichtern, ist die Sammlung von getrockneten Blutflecken ein attraktives Konzept. Nach einer Finger-Stick, sammelt der Patient einen Bluttropfen auf Filterpapier zu Hause. Nachdem das Blut getrocknet ist, es an die analytischen Labor, in dem Tacrolimus wird mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie quantifiziert geschickt wird (HPLC-MS / MS) in Kombination mit einem einfachen Handproteinfällung Schritt und Online-Spaltenextraktion.
Für Tacrolimus Analyse wird eine 6-mm-Scheibe aus dem gesättigten Zentrum der Blutfleck ausgestanzt. Der Blutfleck wird mit einer Kugel ein Mixer homogenisiertnd dann Proteine werden mit Methanol / 0,2 M ZnSO 4, die den internen Standard D 2, 13 C-Tacrolimus fällt. Nach dem Vortexen und Zentrifugieren wird 100 ul Überstand in ein Online-Extraktionskolonne injiziert und mit 5 ml / min von 0,1 Ameisensäure / Acetonitril gewaschen (7: 3, v: v) für 1 min. Danach wird das Schaltventil aktiviert, und die Analyten rückgespült auf die analytische Säule (und getrennt unter Verwendung einer 0,1% Ameisensäure / Acetonitril-Gradient). Tacrolimus wird in der positiven Mehrreaktionsmodus (MRM) mit einem Tandem-Massenspektrometer quantifiziert.
Der Test ist linear von 1 bis 50 ng / ml. Inter-Assay-Varianz (3,6% -6,1%) und Genauigkeit (91,7% -101,6%) als in 20 Tagen beurteilt treffen Akzeptanzkriterien. Durchschnittliche Extraktion Erholung ist 95,5%. Es gibt keine relevante Übertrag, Matrix-Interferenzen und Matrixeffekte. Tacrolimus ist in getrockneten Blutflecken bei RT und bei +4 ° C für 1 Woche stabil. Extrahierten Proben in derProbengeber sind bei +4 ° C für mindestens 72 Stunden stabil.
Introduction
Tacrolimus ist ein potenter immonosuppressant 1-7 die Makrolidstruktur 8 (Figur 1) besitzt. Aufgrund cis – trans-Isomerie der CN Bindungen sie zwei Rotameren in Lösung 9, die durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt werden können bildet (HPLC) Tacrolimus ist lipophil und löslich in Alkoholen (Methanol: 653 g / l, Ethanol: 355 g / L), halogenierte Kohlenwasserstoffe (Chloroform: 573 g / L) und Äther. Es ist in aliphatischen Kohlenwasserstoffen (Hexan kaum löslich: 0,1 g / l und Wasser (pH 3. 0,0047 g / l) 9 Das Molekül keinerlei Chromophor, und das UV-Absorptionsmaximum nicht enthalten, ist 192 nm Tacrolimus über eine Hemmung der Calcineurin wirkt. . Sein Wirkungsmechanismus ist in den Referenzen 10,11 prüft worden. Es ist derzeit in mehr als 80% der Festorgantransplantationspatienten in den Vereinigten Staaten 12 verwendet.
Der therapeutische Index von Tacrolimus ist stattd schmalen 13 zu sein. Darüber hinaus ist die Korrelation zwischen Tacrolimus-Dosen und Konzentrationen im Blut arm und Pharmakokinetik ist variabel 14,15. Therapeutische Medikamentenüberwachung auf Tacrolimus Dosierung bei Transplantationspatienten zu führen ist daher allgemeine klinische Praxis 16-20. Das Ziel ist, die Tacrolimus-Blutkonzentrationen innerhalb einer vorgegebenen therapeutischen Bereich zu halten. Tacrolimus-Blutspiegel unter dem therapeutischen Bereich kann in einer erhöhten Aktivität der chronischen oder akuten Allo-Immunreaktionen führen, während die oberhalb des therapeutischen Fensters erhöhen das Risiko für Über Immunsuppression, Krebs und Toxizitäten, wie Nierentoxizität, Neurotoxizität, Bluthochdruck und Diabetes. Hohe pharmakokinetischen intraindividuellen Schwankungen von Tacrolimus kann sich nachteilig auf beiden Transplantationsorgan und das Überleben der Patienten 21,22 sein. Während interindividuelle Variabilität der Pharmakokinetik von Tacrolimus wird hauptsächlich durch CYP3A5-Polymorphismen, Gründe für intraindividuelle verursachtVariabilität beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Arzneimitteln, krankheits Drogen-und Lebensmittel Wechselwirkungen 14,15 begrenzt. Auch fehlt der Einhaltung der immunsuppressiven Therapie Drogen-Regime ist ein Faktor und ein Hauptgrund für Transplantatverlust 23,24.
Diese Überlegungen zeigen, dass häufige Hause therapeutischen Drug-Monitoring und die Einhaltung von Tacrolimus-Vollblutkonzentration kann vorteilhaft sein, um sicherzustellen, dass Patienten Tacrolimus Exposition innerhalb des gewünschten therapeutischen Fenster zu allen Zeiten. Allerdings, die Logistik und die Kosten der häufigeren therapeutischen Drug-Monitoring, wie es der gängigen klinischen Praxis 15 ist unerschwinglich. Einer der Gründe ist, dass der Patient zu sehen, ein phlebotomist, um die erforderliche venöse Blutprobe gezogen haben. Getrocknetes Blut wurden vor kurzem als attraktives Konzept 25-28 entstanden. Nach einer einfachen Finger-Stick, den Patienten sammelt einen Blutstropfen auf einem speziellen Filterpapierkarte und nach der Blutfleck ist dRied, kann es zu einem zentralen Labor zur Analyse von Tacrolimus und einer anderen Immunsuppressivum, dass der Patient möglicherweise gerade unter zugesandt. Dies hat sich auf die Entwicklung von hochempfindlichen und spezifischen LC-MS / MS-Assays zur Quantifizierung von Tacrolimus und anderen Immunsuppressiva in sehr kleinen Blutvolumina, wie beispielsweise Trockenblut (typischerweise 20 & mgr; l Blut) 25,29-43 möglich. Ein weiterer Vorteil ist, dass minimal-invasive, geringes Volumen Probennahme-Strategien wie Trockenblut therapeutischen Drug-Monitoring und pharmakokinetischen Untersuchungen bei Kleinkindern 28 erheblich erleichtern.
Tacrolimus wird in der Regel in venösen EDTA-Vollblut 15 gemessen. Gründe sind, dass Tacrolimus weitgehend verteilt in Blutzellen und klinische Studien haben eine bessere Korrelation zwischen Tacrolimus Talspiegel im Blut als im Plasma mit klinischen Ereignissen 15,18 ausgewiesen. Zum Vergleich: Die Analyse tacrolimus in getrockneten Blutflecken auf Kapillarblut, die mit der Filterpapiermatrix eingemischt basiert. Dies stellt Herausforderungen in Bezug auf die Solubilisierung von Tacrolimus und mögliche Interferenzen mit der LC-MS / MS-Analyse. Hier präsentieren wir einen etablierten und validierten Assay basierend auf Homogenisierung der getrocknete Blut vor Ort mittels einer Kugel Mixer in Kombination mit einem High-Flow-Online Spalte Probenvorbereitungsverfahren und LC-MS / MS-Analyse. Bis heute hat dieser Test erfolgreich zur Quantifizierung von mehr als fünftausend Tacrolimus Trockenblut-Proben für die Einhaltung Überwachung in klinischen Studien eingesetzt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl, wie oben erwähnt, ist das Konzept der therapeutischen Arzneimittel und Einhaltung Überwachung der Tacrolimus auf Basis von Trockenblut attraktiv, es gibt analytische Herausforderungen, die über die in der Regel mit der LC-MS / MS-Analyse von Tacrolimus im venösen EDTA-Vollblut-Proben verbunden zu gehen. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die Tatsache, dass die Matrix Kappilarblut in die Baumwolllinters Material des hier verwendeten Filterkarte Materials und der geringen Blutvolumen (20 ul)…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.
Materials
| Reference Materials | ||
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 |
| Test Materials | ||
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q |
| Solvents | ||
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9 % | Sigma-Aldrich | 439126-4 L |
| Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 |
| Isopropanol 99.9 %, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 |
| Methanol Optima LC/ MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 |
| Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 |
| Other Chemicals | ||
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 |
| Laboratory Instruments and Consumables | ||
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 |
| 1,5 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 |
| 10 – 100 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 |
| 10 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 |
| 100 – 1000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 |
| 100 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 |
| 1000 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 |
| 2 – 20 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 |
| 2 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 |
| 20 – 200 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 |
| 20 μL- pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 |
| 200 μL- pipet tips with filter | Multimax | 2938T |
| 200 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J |
| 50 mL- Falcon tube | BD Falcon | 352070 |
| 300 μL inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 |
| Glass v ials, 4 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 |
| Glass vials, 20 mL | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S |
| HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B |
| Needle, 18G 1.5 | Precision Glide | 305196 |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 |
| HPLC Equipment and Columns | ||
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 |
| Tandem Mass Spectrometer | ||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
Referências
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
- Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
- . Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
- . A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
- Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
- Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group.. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
- Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
- Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
- Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
- Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
- Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
- Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L., Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. e. b. b. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. , 529-562 (2005).
- Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
- Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
- Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
- Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
- Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
- Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
- Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
- Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
- Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
- Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
- Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
- Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
- Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
- Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
- Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
- Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
- Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
- Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
- Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
- Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
- Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
- Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
- Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
- Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
- Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
- Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
- Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
- Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
- Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
- Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
- Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).
