Quantificazione del immunosoppressore Tacrolimus su macchie di sangue secco Uso LC-MS / MS
Summary
Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
Abstract
Il tacrolimus inibitore della calcineurina è la pietra angolare della maggior parte dei protocolli di trattamento immunosoppressivi dopo il trapianto d'organo solido negli Stati Uniti. Tacrolimus è un farmaco ristretto indice terapeutico e come tale richiede un monitoraggio terapeutico e aggiustamento della dose in base a intere sue concentrazioni ematiche. Per facilitare la casa farmaci terapeutici e monitoraggio aderenza, la raccolta di macchie di sangue essiccato è un concetto interessante. Dopo un dito bastone, il paziente raccoglie una goccia di sangue su carta da filtro a casa. Dopo che il sangue è asciugato, viene inviato al laboratorio di analisi dove tacrolimus è quantificato utilizzando la spettrometria di massa ad alta prestazione cromatografia liquida-tandem (HPLC-MS / MS) in combinazione con un manuale semplice passo precipitazione delle proteine e l'estrazione della colonna in linea.
Per l'analisi tacrolimus, un disco 6 mm è perforato dal centro satura di spot sangue. La macchia di sangue viene omogeneizzato con un proiettile frullatore unnd poi le proteine vengono precipitate con metanolo / 0,2 M ZnSO4 contenente lo standard D interno 2, 13 C-tacrolimus. Dopo vortex e centrifugazione, 100 pl di surnatante viene iniettato in una colonna di estrazione in linea e lavate con 5 ml / min di 0,1 formico acido / acetonitrile (7: 3, v: v) per 1 min. Di seguito, la valvola di commutazione viene attivato e gli analiti sono back-lavata sulla colonna analitica (e separati usando un acido formico / acetonitrile pendenza 0,1%). Tacrolimus è quantificato in modalità positiva Multi reazione (MRM) usando uno spettrometro di massa tandem.
Il saggio è lineare da 1 a 50 ng / ml. Variabilità inter-assay (3,6% -6,1%) e l'accuratezza (91,7% -101,6%), valutato in 20 giorni soddisfano criteri di accettazione. Recupero medio estrazione è 95,5%. Non ci sono rilevanti riporto, le interferenze della matrice e effetti matrice. Tacrolimus è stabile nelle macchie di sangue essiccato a temperatura ambiente ea 4 ° C per 1 settimana. Campioni estratti incampionatore sono stabili a + 4 ° C per almeno 72 ore.
Introduction
Tacrolimus è un potente immonosuppressant 1-7 che ha una struttura macrolide 8 (Figura 1). A causa di cis – isomeria trans dei legami CN forma due rotameri in soluzione 9 che possono essere separati da fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) Tacrolimus è lipofila e solubile in alcoli (metanolo: 653 g / L, etanolo: 355 g / L), idrocarburi alogenati (cloroformio: 573 g / L) ed etere. E 'scarsamente solubile in idrocarburi alifatici (esano: 0,1 g / L e acqua (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 La molecola non contiene alcun cromofori e la sua massima UV-assorbimento è di 192 nm Tacrolimus agisce attraverso l'inibizione della calcineurina. . Il suo meccanismo d'azione è stato rivisto in riferimenti 10,11. Attualmente è utilizzato in oltre l'80% dei pazienti sottoposti a trapianto di organi solidi negli Stati Uniti 12.
L'indice terapeutico di tacrolimus è considered per essere stretto 13. Inoltre, la correlazione tra le dosi di tacrolimus e concentrazioni nel sangue è scarsa e la farmacocinetica è variabile 14,15. Il monitoraggio terapeutico per guidare tacrolimus dosaggio in pazienti sottoposti a trapianto è pertanto la pratica clinica generale 16-20. L'obiettivo è quello di mantenere le concentrazioni di tacrolimus nel sangue entro un range terapeutico predefinito. Le concentrazioni ematiche tacrolimus al di sotto del range terapeutico possono tradursi in una maggiore attività di reazioni allo-immunitario cronici o acuti, mentre concentrazioni superiori al finestra terapeutica aumentano il rischio di sovra-immunosoppressione, il cancro e tossicità, quali nefrotossicità, neurotossicità, ipertensione e diabete. Alta farmacocinetica variabilità individuale di tacrolimus può essere dannoso sia per trapianto di organi e la sopravvivenza del paziente 21,22. Mentre variabilità inter-individuale di farmacocinetica di tacrolimus è causata principalmente da polimorfismi CYP3A5, ragioni intra-individualevariabilità includono, ma non sono limitati a, farmaco-farmaco, malattia-droga e cibo-farmaco interazioni 14,15. Anche la mancanza di aderenza alla terapia immunosoppressiva terapeutico è un fattore e una delle ragioni principali per la perdita del trapianto 23,24.
Queste considerazioni suggeriscono che spesso a casa di farmaci terapeutici e il monitoraggio di aderenza della concentrazione ematica complessiva può essere utile al fine di garantire che i pazienti abbiano l'esposizione tacrolimus all'interno della finestra terapeutica desiderata in ogni momento. Tuttavia, la logistica e il costo di più frequente monitoraggio terapeutico in quanto è in corso la pratica clinica 15 è proibitivo. Uno dei motivi è che il paziente deve vedere un prelevatore di avere il campione di sangue venoso richiesto disegnata. Macchie di sangue secco sono recentemente emersi come un concetto attraente 25-28. Dopo una semplice dito attaccare il paziente raccoglie una goccia di sangue su una speciale carta di carta da filtro e dopo che la macchia di sangue è dried, può essere inviato ad un laboratorio centrale per l'analisi di tacrolimus e qualsiasi altro immunosoppressore che il paziente può essere attualmente in corso. Questo è diventato possibile grazie allo sviluppo di test LC-MS / MS altamente sensibili e specifici per la quantificazione di tacrolimus e di altri immunosoppressori in volumi molto piccoli di sangue come macchie di sangue essiccato (in genere 20 microlitri di sangue) 25,29-43. Un altro vantaggio è che minimamente invasive, strategie a basso volume di raccolta dei campioni, come macchie di sangue essiccato facilitano notevolmente monitoraggio terapeutico e studi di farmacocinetica in bambini piccoli 28.
Tacrolimus è di solito misurata in EDTA venoso sangue intero 15. Le ragioni sono che tacrolimus distribuisce ampiamente in cellule del sangue e che gli studi clinici hanno riportato una migliore correlazione tra le concentrazioni di valle di tacrolimus nel sangue rispetto al plasma con eventi clinici 15,18. In confronto, l'analisi di tacrolimus in macchie di sangue essiccato è basato su sangue capillare che viene miscelato con la matrice carta da filtro. Questo rappresenta una sfida in termini di solubilizzazione di tacrolimus e potenziali interferenze con l'analisi LC-MS / MS. Presentiamo qui un test stabilito e convalidato in base omogeneizzazione della macchia di sangue secco con un frullatore proiettile in combinazione con un alto flusso colonna linea campione ripulire procedura e analisi LC-MS / MS. Ad oggi, questo test è stato utilizzato con successo per la quantificazione di oltre cinquemila tacrolimus secca campioni blood spot per il monitoraggio aderenza negli studi clinici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se, come detto, il concetto di farmaco terapeutico e monitoraggio aderenza tacrolimus basato su macchie di sangue essiccato è attraente, ci sono sfide analitiche che vanno oltre quelli tipicamente associati con l'analisi LC-MS / MS di tacrolimus in EDTA venosa campioni di sangue intero. Questi includono, ma non sono limitati a, il fatto che la matrice è sangue intero capillare imbevuto nel materiale linters di cotone del materiale carta filtro usato qui e il volume di sangue (20 ml). Tuttavia, l'analisi …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.
Materials
| Reference Materials | ||
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 |
| Test Materials | ||
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q |
| Solvents | ||
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9 % | Sigma-Aldrich | 439126-4 L |
| Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 |
| Isopropanol 99.9 %, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 |
| Methanol Optima LC/ MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 |
| Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 |
| Other Chemicals | ||
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 |
| Laboratory Instruments and Consumables | ||
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 |
| 1,5 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 |
| 10 – 100 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 |
| 10 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 |
| 100 – 1000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 |
| 100 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 |
| 1000 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 |
| 2 – 20 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 |
| 2 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 |
| 20 – 200 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 |
| 20 μL- pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 |
| 200 μL- pipet tips with filter | Multimax | 2938T |
| 200 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J |
| 50 mL- Falcon tube | BD Falcon | 352070 |
| 300 μL inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 |
| Glass v ials, 4 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 |
| Glass vials, 20 mL | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S |
| HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B |
| Needle, 18G 1.5 | Precision Glide | 305196 |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 |
| HPLC Equipment and Columns | ||
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 |
| Tandem Mass Spectrometer | ||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
Referências
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
- Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
- . Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
- . A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
- Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
- Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group.. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
- Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
- Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
- Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
- Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
- Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
- Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L., Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. e. b. b. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. , 529-562 (2005).
- Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
- Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
- Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
- Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
- Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
- Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
- Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
- Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
- Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
- Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
- Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
- Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
- Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
- Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
- Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
- Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
- Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
- Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
- Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
- Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
- Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
- Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
- Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
- Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
- Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
- Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
- Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
- Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
- Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
- Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
- Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).
