LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화
Summary
Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
Abstract
칼시 뉴린 억제제 타 크롤리 무스는 미국에서 고체 장기 이식 후 대부분의 면역 치료 프로토콜의 초석이다. 타 크롤리 무스는 좁은 치료 지수 약물이며, 등은 치료 적 약물 모니터링 및 전체 혈액 통 농도를 기반으로 용량 조절이 필요합니다. 가정 치료 약물 및 준수 모니터링을 용이하게하기 위해, 건조 혈액 명소의 컬렉션은 매력적인 개념이다. 핑거 스틱 후, 환자는 집에서 필터 종이에 혈액 방울을 수집한다. 혈액이 건조 된 후에는 타크로리무스는 고성능 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법을 이용하여 정량화 분석 실험실로 송부 (HPLC-MS / MS) 간단한 수동 단백질 침전 단계 및 온라인 열 추출과 조합.
타 크롤리 무스 분석을 위해, 6 mm 디스크는 혈액 스폿의 중심으로부터 펀칭 포화된다. 혈액 자리는 총알 블렌더를 사용하여 균질화ND 후 단백질은 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4 내부 표준 D 2, C-13을 함유 타크로리무스로 침전된다. 볼 텍싱 및 원심 분리 후, 상청액 100 μL를가 온라인 추출 칼럼에 주입하고, 5 ㎖ / 0.1 포름산 / 아세토 니트릴로 세정 분 (7 : 3, V : V) 1 분. 이하, 전환 밸브가 작동하고 분석 물은 분석 컬럼에 백 플러시 (및 0.1 % 포름산 / 아세토 니트릴 구배를 사용하여 분리)된다. 타크로리무스는 탠덤 질량 분석 장치를 사용하여 다중 반응 양성 모드 (MRM)으로 정량화된다.
분석은 50 ng 내지 1 / ㎖에서 선형이다. 로 이십일에 걸쳐 평가 간 분석 변동 (3.6 % -6.1 %)과 정확성 (91.7 % -101.6 %)이 허용 기준을 충족. 평균 추출 회수는 95.5 %이다. 이월, 매트릭스 간섭 및 매트릭스 효과 아무런 관련이 없습니다. 타 크롤리 무스는 실온에서 1 주일 동안 4 ℃에서 건조 혈액 명소에서 안정적이다. 에서 추출 된 샘플오토 샘플러는 최소 72 시간 동안 4 ℃에서 안정하다.
Introduction
타 크롤리 무스는 마크로 라이드 구조 (8) (그림 1)이 강력한 immonosuppressant 1-7이다. 653g / L, 에탄올 : – 시스로 인한 CN 결합의 트랜스 이성질체는 역상 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리 될 수있는 용액을 9 개의 로타 머를 형성한다 (HPLC)은 타 크롤리 무스는 알코올 (메탄올 중의 지용성 및 수용성 355 G / L), 할로겐화 탄화수소 (클로로포름 : 573g / L) 및 에테르. . 0.1 G / L 및 물 (pH를 3 : 그것은 지방족 탄화수소 (헥산에 난 용성이다. 분자가 어떤 발색단과 자외선 최대 흡수를 포함하지 않는 9 0.0047 g / L) 칼시 뉴린 억제를 통해 192 nm의 타 크롤리 무스의 역할입니다 . 그 작용 메커니즘은 참조 10,11에서 검토되었다. 현재는 미국 (12)에 고체 기관 이식 환자의 80 % 이상으로 사용된다.
타크로리무스의 치료 지수는 considere있는 것이다D 13 좁은합니다. 또한, 타 크롤리 무스 및 투여 혈중 농도 간의 상관 관계는 좋지는 14,15 및 약동학 변수이다. 이식 환자에서 타 크롤리 무스 투여를 안내하는 치료 약물 모니터링 따라서 일반적으로 임상 실습 16 ~ 20입니다. 목표는 미리 정의 된 치료 범위 내에 타크로리무스의 혈중 농도를 유지하는 것이다. 치료 창 이상의 농도가 과다 면역, 암 등의 신 독성, 신경 독성, 고혈압, 당뇨병 등의 독성에 대한 위험이 증가하는 동안 치료 적 범위보다 타크로리무스 혈중 농도는 만성 또는 급성 동종 면역 반응의 활성이 증가 될 수 있습니다. 타 크롤리 무스의 높은 약동학 내 개인 변동성 이식 기관과 환자 생존율 (21, 22) 모두에 해가 될 수있다. 타 크롤리 무스의 약동학의 간 개별 변동은 주로 CYP3A5 다형성, 내 개인에 대한 이유에 의해 발생되는 동안변동성이 포함되지만, 약물 – 약물, 질병 – 약물 및 식품 – 약물 상호 작용 14, 15에 한정되는 것은 아니다. 또한 면역 억제 치료 약물 처방을 준수의 부족은 요인 및 이식 손실 (23, 24)에 대한 주요 이유입니다.
이러한 고려 사항은 빈번한 홈 치료약 및 타크로리무스 전혈 농도 부착 모니터링 환자가 항상 원하는 치료 창 내 타크로리무스 노출을 가질 수 있도록하는 것이 유익 할 수 있음을 시사한다. 그러나, 현재의 임상 15 금지 인 물류 및 더 빈번한 모니터링 치료약의 비용 때문이다. 그 이유 중 하나는 환자 phlebotomist 그린 필요한 정맥 혈액 샘플을 가지고 참조한다는 것이다. 말린 혈액 반점은 최근에 매력적인 개념 25-28로 등장했다. 환자 스틱 간단한 손가락 한 것은 특수 필터 종이 카드 및 혈액 자리가 거라고 한 후 혈액 방울을 수집리 에드, 그것은 타 크롤리 무스의 분석과 환자가 현재 복용 될 수 있음을 다른 면역 억제제를위한 중앙 실험실로 발송 될 수있다. 이는 건조 혈액 명소 (혈액의 일반적으로 20 μL) 25,29-43로 인해 아주 작은 혈액 볼륨에서 타 크롤리 무스와 다른 면역 억제제의 정량에 매우 민감하고 특정 LC-MS는 / MS 분석의 개발이 가능하게되었다. 또 다른 장점은 건조 혈액 명소로 최소 침습, 낮은 볼륨 시료 채취 전략은 크게 어린이 (28)의 치료 적 약물 모니터링 및 약동학 적 연구를 촉진한다는 것이다.
타 크롤리 무스는 일반적으로 정맥 EDTA 전혈 (15)로 측정됩니다. 이유는 타 크롤리 무스가 광범위하게 혈액 세포로 배포하는 것이 임상 연구는 임상 이벤트 15,18 플라즈마에 비해 혈중 타 크롤리 무스 통 농도 사이 좋은 상관 관계를보고했다고한다. 비교하여, TA의 분석건조 혈액 반점에서 crolimus은 여과지 매트릭스와 혼합 모세관 혈액에 기초한다. 이것은 LC-MS / MS 분석으로 타크로리무스 및 잠재적 간섭의 가용화면에서 과제를 제시한다. 여기에서 우리는 높은 흐름 온라인 열 샘플 정리 절차 및 LC-MS / MS 분석과 함께 총알 블렌더를 사용하여 건조 혈액 자리의 균질화를 기반으로 설립 검증 분석을 제시한다. 오늘날,이 분석은 임상 시험을 성공적으로 부착 모니터링 이상의 오천 타크로리무스 건조 혈액 샘플의 스폿 정량화에 사용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전술 한 바와 같이, 건조 혈액 반점에 기초 치료약 및 타 크롤리 무스의 부착 모니터링 개념 매력적이며, 비록 전형적 정맥 EDTA 전혈 샘플에 타크로리무스의 LC-MS / MS 분석과 연관된 넘어 분석 과제가있다. 이들은 다음을 포함하지만, 여기에 사용되는 행렬은 필터 카드 재료와 저 혈량 (20 μL)의 코튼 린터 재료에 담가 모세관 전혈 사실, 이에 한정되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 중앙 연구소에서 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.
Materials
| Reference Materials | ||
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 |
| Test Materials | ||
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q |
| Solvents | ||
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9 % | Sigma-Aldrich | 439126-4 L |
| Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 |
| Isopropanol 99.9 %, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 |
| Methanol Optima LC/ MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 |
| Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 |
| Other Chemicals | ||
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 |
| Laboratory Instruments and Consumables | ||
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 |
| 1,5 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 |
| 10 – 100 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 |
| 10 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 |
| 100 – 1000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 |
| 100 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 |
| 1000 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 |
| 2 – 20 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 |
| 2 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 |
| 20 – 200 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 |
| 20 μL- pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 |
| 200 μL- pipet tips with filter | Multimax | 2938T |
| 200 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J |
| 50 mL- Falcon tube | BD Falcon | 352070 |
| 300 μL inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 |
| Glass v ials, 4 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 |
| Glass vials, 20 mL | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S |
| HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B |
| Needle, 18G 1.5 | Precision Glide | 305196 |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 |
| HPLC Equipment and Columns | ||
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 |
| Tandem Mass Spectrometer | ||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
Referências
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