Aqui descrevemos um ensaio de cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa em tandem (HPLC-MS/MS) para quantificar o imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco usando uma etapa de precipitação de proteína manual simples e extração em coluna online.
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Artigo de método
Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tacrolimus inibidor da calcineurina é a pedra angular da maioria dos protocolos de tratamento imunossupressores após transplante de órgão sólido nos Estados Unidos. Tacrolimus é uma droga estreito índice terapêutico e, como tal, exige monitorização terapêutica e ajuste de dose com base em toda a sua concentrações mínimas no sangue. Para facilitar casa droga terapêutica e monitoramento da adesão, a coleta de gotas de sangue seco é um conceito atraente. Depois de uma picada no dedo, o paciente recebe uma gota de sangue em papel de filtro em casa. Depois de o sangue é seca, que é enviado para o laboratório de análises, onde o tacrolimus é quantificada usando espectrometria de massa líquida de alta eficiência A cromatografia-tandem (HPLC-MS / MS), em combinação com um manual simples passo de precipitação de proteína e de extracção em linha da coluna.
Para a análise de tacrolimus, um disco de 6 mm é perfurado a partir do centro do local saturada de sangue. A mancha de sangue é homogeneizada utilizando um misturador de uma balaND, em seguida, as proteínas são precipitadas com metanol / 0,2 M ZnSO4 contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus. Após agitação em vórtice e centrifugação, 100 ul de sobrenadante foi injectada numa coluna de extracção em linha e lavou-se com 5 mL / min de ácido fórmico a 0,1 / acetonitrilo (7: 3, v: v) durante 1 min. Daqui por diante, a válvula de comutação é activada e os analitos são back-lavada na coluna analítica (e separados utilizando um gradiente de ácido fórmico / acetonitrilo a 0,1%). O tacrolimus é quantificada no modo positivo de multi reacção (MRM) usando um espectrómetro de massa em tandem.
O ensaio é linear de 1 a 50 ng / ml. A variabilidade inter-ensaio (3,6% -6,1%) e precisão (91,7% -101,6%), avaliada durante 20 dias satisfazer os critérios de aceitação. A recuperação média de extração é de 95,5%. Não há carry-over, interferências de matriz e efeitos de matriz relevante. O tacrolimus é estável em manchas de sangue seco em temperatura ambiente e a +4 ° C durante 1 semana. Amostras extraídas doamostrador automático são estáveis a 4 ° C durante pelo menos 72 h.
Introdução
O tacrolimus é um potente immonosuppressant 1-7 que tem uma estrutura de macrólido 8 (Figura 1). Devido a cis - isomerismo trans das ligações NC que forma dois rotâmeros em solução 9 que podem ser separados por cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (HPLC) Tacrolimus é lipofilico e solúvel em álcoois (metanol: 653 g / L, etanol: 355 g / L), hidrocarbonetos halogenados (clorofórmio: 573 g / L) e éter. É moderadamente solúvel em hidrocarbonetos alifáticos (hexano: 0,1 g / L e de água (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 A molécula não contém quaisquer cromóforo e o seu máximo de absorçã....
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Protocolo
Amostras de sangue identificadas-de de indivíduos saudáveis eram do Hospital da Universidade de Colorado (Aurora, Colorado). O uso de amostras de banco de sangue identificou-de para estudos de validação, bem como para a preparação dos calibradores e amostras de controle de qualidade foi considerada "isentos" pelo Conselho Colorado Multi-institucional Análises (COMIRB, Aurora, Colorado).
1. Preparação de Referências e Soluções
- Tacrolimus compra e do padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus a partir dos fornecedores listados na Lista de Materiais.
- Preparar soluções de reserva em metanol puro a uma conc....
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Resultados
Cromatogramas iónicos representativos de uma amostra em branco, uma amostra enriquecida para o limite inferior de quantificação e uma amostra do paciente são apresentados na Figura 3.
As curvas de calibração
O limite inferior de detecção foi de 0,5 ng / ml e o limite inferior de quantificação foi de 1,0 ng / ml. Cinquenta ng / ml foi escolhido como o mais alto calibrador como concentrações mais elevadas não são susceptíveis de se.......
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Discussão
Embora, como acima mencionado, o conceito de fármaco terapêutico e monitorização aderência do tacrolimus com base em manchas de sangue seco é atraente, existem desafios analíticos que ultrapassam aquelas tipicamente associados com a análise por LC-MS / MS do tacrolimus em EDTA venoso amostras de sangue inteiro. Estes incluem, mas não estão limitados a, o facto de a matriz capilar é sangue completo embebido no material de fibras de algodão do material de cartão de filtro usado aqui e o baixo volume de sangue (20 ul). No .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo contrato da Federal Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos HHSF223201310224C e pelo United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Farmacopeia dos EUA | Tacrolimus | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | ||
| Glóbulos vermelhos | Hospital da Universidade do Colorado | W20091305500 V | |
| Plasma | Hospital da Universidade do Colorado | W2017130556300Q | |
| Acetona CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| Acetonitrila Optima LC / MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Isopropanol 99,9%, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Metanol Optima LC / MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Water Optima LC / MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Ácido fórmico | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sulfato de zinco | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| tubo Eppendorf de 1,5 ml | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µ l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μ l pontas de pipeta com filtro, estéril | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1.000 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μ l pontas de pipeta com filtro, estéril | Neptune | BT 100 | |
| 1.000 μ l pontas de pipeta com filtro, estéril | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| tubo Eppendorf de 2 ml | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µ l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μ l pontas de pipeta com filtro, estéril | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μ l pontas de pipeta com filtro | Multimax | 2938T | |
| 200 μ l pontas de pipeta com filtro, estéril | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Tubo Falcon | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μ l inserções para frascos de HPLC | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogeneizador | Next Advance | BBX24 | |
| Centrífuga Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| Toalhetes | DescartáveisPDI | Q55172 | |
| Vidros de vidro, 4 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Frascos de vidro, 20 ml | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Luvas, nitrilo | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| Frascos de HPLC, 9 mm, 2 ml, transparente | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| Tampas para frascos de HPLC | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Agulha, 18 G 1.5 | Precision Glide | 305196 | |
| Rack para tubos Eppendorf | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Rack para Frascos de HPLC | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Contas de aço 0,9 - 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| Caixas de armazenamento para freezers / refrigeradores | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 | |
| Vórtice multi-tubo padrão | VWR Produtos Científicos | 658816-115 | |
| Papel Whatman, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Amostrador Automático | CTC PAL | amigo. HTCABIx1 | |
| Bomba binária, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Bomba binária, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Micro desgaseificador a vácuo, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Forno de coluna, Agilent 1290 com 2 posições | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Compartimento de coluna termostatizado com válvula de comutação integrada de 6 portas | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| Cartucho de pré-coluna HPLC, Zorbax XDB C8 (5 µ m tamanho de partícula), 4,6 · Coluna | Phenomenex | 820950-926 | |
| , Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µ m tamanho de partícula), 4,6 · Espectrômetro | |||
| API5000 MS/MS com fonte de TurboIonspray | AB Sciex | 4364257 | |
| Software de espectrometria de massa | AB Sciex | Analyst 1.5.1 | |
Referências
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S.
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Reimpressões e permissões
