Funktionell beredning och Kanalaktivitets Mätningar av renat Vildtyps och Mutant CFTR Protein
Summary
Beskrivet här är ett snabbt och effektivt förfarande för funktionell rekonstitution av renat vildtyp och muterade CFTR-protein som bevarar aktiviteten för denna kloridkanal, vilken är defekt i cystisk fibros. Jodid utflöde från ombildade proteoliposomer förmedlade av CFTR tillåter studier av kanalaktivitet och effekterna av små molekyler.
Abstract
Den cystisk fibros transmembran (CFTR) är en unik kanal bildande medlem av ATP Binding Cassette (ABC) superfamiljen av transportörer. Den fosforylering och nukleotid beroende kloridkanal aktivitet CFTR har ofta studerats i hela cellsystem och som enstaka kanaler i utskurna membran patchar. Många Cystisk fibros framkallande mutationer har visat att ändra denna verksamhet. Medan ett litet antal reningsprotokoll har publicerats, har en snabb beredning metod som bibehåller kanalaktivitet och en lämplig metod för att studera befolkningskanalaktivitet i ett renat systemet saknats. Här snabba metoder beskrivs för rening och funktionell beredning av fullängds CFTR protein i proteoliposomer av definierad lipidsammansättning som behåller aktivitet som en reglerad halid kanal. Denna beredning metoden tillsammans med en ny flödesbaserad analys av kanalaktivitet är ett lämpligt system förstudera befolkningskanalegenskaper vildtyp CFTR och sjukdomsalstrande mutanter F508del- och G551D-CFTR. Specifikt har metoden verktyget studera de direkta effekterna av fosforylering, nukleotider och små molekyler såsom potentiatorer och inhibitorer på CFTR kanalaktivitet. Metoderna är också mottagliga för studiet av andra membran kanaler / transportörer för anjoniska substrat.
Introduction
Chloride transport över de apikala membran av epitelceller i sådana vävnader som lung, tarm, bukspottkörtel och svettkörtlar är främst förmedlas av cystisk fibros transmembran (CFTR), en ATP och fosforylering reglerade medlem av ABC (ATP Bindande Kassett) C underfamiljen av membranproteiner (över i 1). Liksom andra medlemmar av ABCC underfamiljen är CFTR en stor, multi-spänner integrerad membranprotein som binder ATP vid två nukleotid bindningsställen bildas i gränssnittet mellan dess nukleotid-bindande domäner (NBDs), där den har blyg ATPas aktivitet vid en enda plats. Men till skillnad från andra ABCC underfamilj medlemmar, har CFTR utvecklats som en unik reglerad Cl-kanalen snarare än som en aktiv löst ämne transportör.
Mutationer i CFTR orsak Cystisk fibros, en sjukdom som drabbar flera organ inklusive lungor, mag-tarmkanalen, pankreas och reproduktionsorganen, vilket leder till Morbidity och dödlighet hos unga vuxna. Lungsjukdom står normalt för tidig dödlighet i cystisk fibros och i de flesta fall orsakas av förlusten av CFTR funktion på ytan epitel av övriga luftvägarna. Avsaknaden av CFTR kloridkanalaktivitet orsakar en minskning av både Cl – och vatten rörelse över ytan epitelet för att modifiera fluidskiktet på den apikala ytan av cilierade respiratoriska epitelet. Detta resulterar i en viskös luftväg ytvätska som försämrar förmågan hos cilierespirator epitelceller för att effektivt klara patogener ur luftvägarna. Som en följd har de flesta CF-patienter lider av återkommande anfall av lunginfektion och lungskador på grund av inflammation.
Som väntat, studier av verkningsmekanismen för den normala CFTR proteinet främst inriktat på detaljerade elektrofysiologiska studier av dess kanal gating aktivitet. Enkanaliga studier har visat direkt att CFTR fungerar som en PKA-beroende Cl– Kanal som besitter en ATP reglerad grind 2. Detaljerade elektrofysiologiska studier ger en hel del information om enskilda CFTR kanaler 1,3, men det kan finnas oro över huruvida de egenskaper hos någon särskild kanal som har studerats är reflekterande av hela befolkningen i CFTR kanaler och därför enda kanal Resultaten bör alltid övervägas tillsammans med metoder för att studera den makroskopiska befolkningen. Direkt analys av kanalverksamhet renat CFTR befolkningen har potential att ge en inblick i den molekylära defekten i samband med sjukdomsframkallande mutationer och driva upptäckten av kemiska modulatorer som reparation mutant CFTR proteiner. Hittills finns det överstigande 1.900 olika mutationer i CFTR tros orsaka cystisk fibros 4. Den stora mutationen, F508del-CFTR, finns på minst en allel hos ca 90% av patienterna i Nordamerika och Europa leder till protein misfolding ennd retention i endoplasmanätet 5. F508del-CFTR har även andra följder, bland annat defekt kanalaktivitet 6-9. Den resulterande frånvaron av CFTR från cellytan är associerad med allvarlig sjukdom. G551D-CFTR, en mindre vanlig mutation, tros vara ordentligt vikta ännu är dysfunktionell som kloridkanal på cellytan 6. Utvecklingen av småmolekylära correctors och potentiatorer har som mål att korrigera vikning och / eller handel med mutanter såsom F508del-CFTR till cellytan, och förstärkande eller öka kanalaktiviteten av mutationer som G551D då närvarande på cellytan, respektive . Medan correctors VX-809 och VX-661 (ännu ej är godkända för användning på patienter, potentiatom Kalydeco (ivacaftor; VX-770) används på 150 mg var 12 timme i CF-patienter> 6 år med minst en G551D -CFTR mutation, och på senare tid för patienter med en av G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Poch G1349D. Kalydeco är både säker och resulterar i en förbättring av kliniska mått på CF sjukdom 10, men verkningsmekanismen för denna lilla molekyl var dåligt förstådd vid tidpunkten för godkännande av FDA för användning på patienter.
En handfull CFTR reningsmetoder har beskrivits tidigare 2,11-18, av vilka många kräver en avsevärd tid att slutföra. I en nyligen publicerad 19, var en unik snabb rening och rekonstitution metod som beskrivits för CFTR uttrycks i Sf 9 cellexpressionssystem, och detta renade proteinet i definierade lipidsystem användes för att utveckla en CFTR halogenid kanalaktivitetsanalys för en population av CFTR molekyler. Analysen rekapitulerar de kända effekterna av fosforylering, nukleotider och hämmare på CFTR funktion. Systemet användes för att förhöra effekterna av potentiator VX-770 / Kalydeco på vikt- (vildtyp), F508del- och G551D-CFTR och det visades för förstatid som läkemedlet interagerar direkt med CFTR-proteinet att förstärka sin kanalaktivitet i en ATP-oberoende sätt, vilket visar nyttan och användbarheten av dessa metoder för att studera interaktionen mellan CFTR och mutanter med nukleotider och små molekyler från ett befolkningsperspektiv till svara kliniskt relevanta frågor om proteinet. Metoderna har också använts för att studera andra potentiator molekyler och deras derivat 20, samt effekterna av en liten molekyl corrector på aktiviteten hos proteinet 21.
Utflödes analyser har använts i många studier som tidigare för att undersöka aktiviteten av CFTR mutanter och effekterna av CFTR-moduler föreningar på sin verksamhet, inklusive hela cellanalyser med användning elektroder, radioaktiva spårämnen och fluoroforer 22,23, membranvesikler med jonselektiva elektroder 24 och renas rekonstruerad CFTR med radioaktiva spårämnen 25. Emellertid the användningen av jonselektiva elektroder för att studera renas rekonstituerad CFTR rapporterades först nyligen 19. En anpassning av den nuvarande metoden har använts för beredning och funktionell karakterisering av två membranproteiner i Pseudomonas aeruginosa, en gemensam CF patogen. Beredning av renat Alge yttermembranproteinkopplade med jodid mätningar utflödes användes för att stödja en modell för anjoniska alginat sekre genom denna transportör 26. Upplösning och jodid mätningar utflödes applicerades på det renade Wzx protein, vilket tillät en modell som kommer att föreslås som antyder en H + -beroende antiport mekanism för lipid bunden oligosackarid sloka över bakteriella inre membranet av detta protein 27. I båda fallen var jodid användes som ett surrogat för det anjoniska substratet, om än i lägre genomströmning än man kan förvänta sig för en infödd substrat. Förfarandet kan vara lämpligt för anpassning till andra proteiner med cationic transport- eller ledningsvägar för anjoniska substrat.
Här ett snabbt förfarande renings beskrivs för CFTR-proteinet och dess beredning i proteoliposomer av definierade lipid. Den snabba Förfarandet beredning kan lätt anpassas för användning med CFTR renas genom andra metoder, förutsatt att den typ av rengöringsmedel som används vid reningen är mottaglig för borttagning av de metoder som används här eller kan bytas ut mot ett lämpligt rengöringsmedel före beredning. Den jodid utflödesmetod för mätning av kanalaktiviteten av renad och rekonstitueras CFTR-protein beskrivs i detalj och några typiska resultat som kan erhållas från detta förfarande presenteras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har funnits ett begränsat antal reningsprotokoll för fullängds, funktionell CFTR isolering, från en mängd olika cellulära överuttryck system. Metoden som beskrivs här är fördelaktigt eftersom det möjliggör en snabb rening av Wt-CFTR eller hög anrikning av F508del- och G551D-CFTR i måttliga mängder som är mycket funktionell i analyser inklusive ATPas och direkta mätningar av kanalfunktion, inklusive enkanaliga mätningar i plana tvåskiktsmembran system och visat åtgärder av CFTR befolkningskanalfu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
Referências
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
