Многогранная Преимущества белка ко-экспрессия в<em> Кишечная палочка</em
Summary
Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.
Abstract
We report here that the expression of protein complexes in vivo de Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.
Introduction
Введение избыточной экспрессии технологий увеличили либо биохимических исследований низкокопийных количество ферментов и промышленного производства фармакологически активных белков (например, инсулина). С появлением этих технологий, значительные успехи были достигнуты повысить выход и качество рекомбинантных белков. Кроме того, прокариотические 1,2 и эукариот 3 избыточная экспрессия системы были разработаны на протяжении многих лет, предлагая полезные альтернативы "рабочая лошадка" белка биотехнологии, т.е. кишечной палочки. В частности, наличие альтернативных платформ Е. палочка привела к продукции рекомбинантных пептидов или белков, несущих посттрансляционных модификаций. Тем не менее, следует отметить, что E. палочка-прежнему представляет собой организм выбора для получения рекомбинантного белка. Это связано с несколькими факторами, среди которых наиболее актуальными могут бытьсчитается: я) наличие целого ряда избыточной экспрессии систем (векторов экспрессии и деформаций) для E. палочка 1,2; II) раз короткий поколения, и высокие урожаи биомассы, в Е. палочка в различных богатой и синтетической информации; III) манипулирование поверхностным либо на биохимические и на генетическом уровне этого микроорганизма; IV) выделение штаммов, способных производства токсичных белков 4; v) строительство штаммов, показывающих однородной индукции на уровне населения 5,6. Кроме того, недавно было показано, что системы экспрессии, пригодные для производства Е. палочка из посттрансляционно модифицированных белков могут быть разработаны и изготовлены 2.
В настоящее время белок избыточная экспрессия в основном используется для получения мономерных или гомо-олигомерный белок, чье hypersynthesis могут быть выполнены с помощью одного гена, клонированного в соответствующем плазмиды. Тем не менее, внимание было недавноуделено построению Е. палочки белковых систем совместной экспрессии, сложные производства, в естественных условиях, гетероструктур-олигомерные комплексы 2. Интересно, что первые эксперименты белковой коэкспрессии обратился к межвидовое сборку больших и малых субъединиц цианобактерий рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу / оксигеназа 7,8 и Ассоциация укороченных и полнометражных форм ВИЧ-1 обратной транскриптазы 9. Эти пионерские исследования показали, что белок ко-экспрессия представляет собой мощный альтернативой традиционным в пробирке восстановления. Кроме того, белок совместная экспрессия в Е. палочки использовали для получения различных белков, несущих посттрансляционных модификаций 2, чтобы получить белки, содержащие неприродные аминокислоты 2, и увеличить выход избыточной экспрессии мембранных белков 2. Кроме того, потенциал белка коэкспрессии в качестве инструмента для придания Е. палочка конкурироватьсть в секреции белка находится в стадии активной расследования 2.
Две основные стратегии белка сотрудничества экспрессии в E. палочка может осуществляться: я) использование одного плазмиды на проведение различных генов сверхэкспрессируется; б) использование нескольких плазмид в единичных клетках, чтобы совместно выразить целевые белки. В первом случае критерии выбора плазмиды не отличаются от тех, традиционных отдельных экспериментов белок избыточной экспрессии, хотя отдельные плазмиды, содержащие тандем элементы промотора / оператора были построены для совместной экспрессии 10. Это первый подход, следовательно, довольно просто. Тем не менее, следует отметить, что использование одного плазмиды совместно выражают различные белки сталкивается с двумя основными трудностями: я) молекулярная масса векторных увеличивается с увеличением количества размещенных генов, ограничивающих количество совместных выразил белков; б) при множественные гены клонируют под контролем единственного промотора, полярность может decreasе экспрессию генов дистальных от промотора. Использование двойных или множественных плазмид в одной Е. палочки клетки должна выполнить совместимость векторов выбора, поэтому введение ограничений на это право комбинаций плазмид. Тем не менее, этот второй стратегии совместная экспрессия есть преимущество, содержащий молекулярную массу векторов, и ограничивает полярность. Мы недавно построили систему совместной экспрессии белка, направленных на облегчение челночного генов между плазмид Коэкспрессия 11. В частности, мы построили серию pGOOD векторы, соответствующие чертами которого являются: я) p15A начала репликации, чтобы обеспечить совместимость pGOOD плазмид с коммерческими векторов, содержащих ColE1 происхождение (например, серии pBAD 12); II) кассета тетрациклина сопротивление; III) наличие Lac -derived регуляторные элементы, т.е. Промоутер-оператора (O 1) пару и Лачи </eм> ген д. С помощью соответствующего pBAD-pGOOD пара, мы смогли сверхэкспрессировать каталитическую ядро Е. полимеразной палочка ДНК III, состоящий из трех разных субъединиц, т.е. α ('полимеразы ε (3'-5 5'-3) "экзонуклеазную) и θ (стабилизирующий ε) 13. В частности, мы показали, что совместная экспрессия с αεθ комплекса строго зависит от дополнение к Е. палочка культуральную среду как IPTG и арабинозы, вызывая избыточная экспрессия от pGOOD и pBAD, соответственно (рис 1А).
В настоящем докладе, мы показывают, как белок, совместная экспрессия может эффективно решать проблемы, связанные с плохой растворимости белкового комплекса субъединицы. Кроме того, мы покажем, как в естественных условиях белковых тестов комплементационных могут быть выполнены, и мы, наконец, доклад об использовании белка коэкспрессии частоте мутаций настроиться на Е. седлоя. С этой целью мы использовали pGOOD-pBAD пары подходящих для иллюстрации соответствующие примеры каждого конкретного случая.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteins can be intrinsically disordered, featuring regions whose tertiary structure is not restricted to a limited number of conformations25. These disordered proteins are usually prone to aggregation25, and their isolation and characterization might represent a difficult task. The ε subunit of E. coli DNA polymerase III features two distinct domains26,27, namely: i) the N-ter domain, bearing the 3’-5’ exonuclease activity, and competent in binding the θ su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The permission by Springer and Elsevier to reprint figures is greatly acknowledged.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
Referências
- Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
- Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
- Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
- Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
- Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
- Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
- Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
- Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
- Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Bioquímica. 41 (16), 5266-5275 (2002).
- Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
- DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Bioquímica. 41 (1), 94-110 (2002).
- Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
- Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
- Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
- Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
- Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
- Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, (2008).
- Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
- Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Bioquímica. 38 (48), 16001-16009 (1999).
- Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
- Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
- Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E., McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).
