Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em> Escherichia coli</em

Summary

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Abstract

We report here that the expression of protein complexes in vivo de Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduction

La introducción de tecnologías de sobreexpresión impulsado cualquiera de los estudios bioquímicos de las enzimas bajo número de copias y la producción industrial de proteínas farmacológicamente activas (por ejemplo, insulina). Desde la llegada de estas tecnologías, los avances se han logrado importantes para aumentar el rendimiento y la calidad de las proteínas recombinantes. Además, los sistemas de sobreexpresión procariotas y eucariotas ^{1,2 3} fueron desarrollados en los últimos años, ofreciendo alternativas útiles a la "caballo de batalla" de la biotecnología de proteínas, es decir, la Escherichia coli. En particular, la disponibilidad de plataformas alternativas a E. coli condujo a la producción de péptidos o proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales recombinantes. Sin embargo, se debe mencionar que la E. coli sigue siendo el organismo de elección para la producción de proteínas recombinantes. Esto se debe a varios factores, entre los cuales los más relevantes se puedenconsiderado: i) la disponibilidad de un buen número de sistemas de sobreexpresión (vectores de expresión y cepas) para E. coli ^1,2; ii) veces el corto generación y altos rendimientos de biomasa, de E. coli en una variedad de medios ricos y sintético; iii) la fácil manipulación ya sea en la bioquímica y en el nivel genético de este microorganismo; iv) el aislamiento de cepas capaces de la producción de proteínas tóxicas ^4; v) la construcción de cepas que ofrecen inducción homogénea a nivel de población ^5,6. Además, se ha demostrado recientemente que los sistemas de expresión adecuados para la producción en E. coli de proteínas después de la traducción modificados se puede diseñar y construir ^2.

En la actualidad, la sobreexpresión de proteínas se utiliza principalmente para obtener proteínas monoméricas o homo-oligómero, cuyos hiperproducción se puede realizar con un solo gen clonado en un plásmido apropiado. Sin embargo, la atención fue recientementepagado a la construcción de E. sistemas de la proteína co-expresión de E. coli, desafiando la producción, in vivo, de complejos hetero-oligoméricos ^2. Curiosamente, los primeros experimentos de la proteína co-expresión se dirigieron a la asamblea inter-especies de grandes y pequeñas subunidades de carboxilasa cianobacterias ribulosa-1,5-bisfosfato / oxigenasa ^7,8, y la asociación de formas truncadas y de longitud completa de VIH-1 transcriptasa inversa ^9. Estos estudios pioneros demostraron que la proteína co-expresión representa una poderosa alternativa a los tradicionales pt la reconstitución in vitro. Además, la proteína co-expresión en E. coli se utilizó para producir diferentes proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales ^2, para obtener proteínas que contienen aminoácidos no naturales ^2, y para aumentar el rendimiento de proteínas de la membrana sobreexpresados ^​​2. Por otra parte, el potencial de la proteína co-expresión como una herramienta para confiere a E. coli competirna vez en la secreción de la proteína está bajo investigación activa ^2.

Dos estrategias principales de proteínas co-expresión en E. coli puede perseguirse: i) el uso de un único plásmido para albergar los diferentes genes que se sobreexpresa; ii) el uso de múltiples plásmidos en células individuales para co-expresar las proteínas diana. En el primer caso, los criterios para la elección del plásmido no difieren de las de los experimentos de sobreexpresión de la proteína individuales tradicionales, aunque plásmidos particulares que contienen elementos en tándem promotor / operador se construyeron para la co-expresión ^10. Por tanto, esta primera aproximación es bastante simple. Sin embargo, se debe mencionar que el uso de un único plásmido para co-expresar diferentes proteínas se enfrenta a dos dificultades principales: i) la masa molecular de los vectores aumenta con el número de genes alojados, lo que limita el número de proteínas co-expresó; ii) cuando múltiples genes se clonan bajo el control de un único promotor, de polaridad puede decrease la expresión de los genes distales del promotor. El uso de plásmidos dobles o múltiples en una sola E. células de E. coli tiene que lograr la compatibilidad de los vectores de elección, por lo tanto, la imposición de limitaciones a las combinaciones admisibles de plásmidos. Sin embargo, esta segunda estrategia de co-expresión cuenta con la ventaja de contener la masa molecular de los vectores, y limita la polaridad. Recientemente hemos construido un sistema de co-expresión de la proteína diseñada para facilitar el vaivén de genes entre los plásmidos co-expresión ^11. En particular, se construyó la serie vectores PGOOD, las características relevantes de los cuales son los siguientes: i) un origen de replicación p15A, para proporcionar compatibilidad de los plásmidos PGOOD con los vectores comerciales que contiene el origen ColE1 (por ejemplo, la serie pBAD ^12); ii) un casete de resistencia a tetraciclina; iii) la presencia de lac -derivado elementos reguladores, es decir, el promotor-operador (O ₁₎ par y el lacI </em> ^q gen. El uso de un par pBAD-PGOOD apropiado, hemos sido capaces de sobreexpresan el núcleo catalítico de E. coli DNA polimerasa III, compuesto de tres subunidades diferentes, es decir, α (la 'de la polimerasa, ε (la 3'-5 5'-3)' exonucleasa) y θ (ε estabilización) ^13. En particular, hemos demostrado que la co-expresión del complejo αεθ era estrictamente dependiente de la adición a la E. coli medio de cultivo tanto de IPTG y arabinosa, desencadenando la sobreexpresión de PGOOD y pBAD, respectivamente (Figura 1A).

En el presente informe, se expone cómo la proteína co-expresión puede resolver eficientemente las dificultades vinculadas a la mala solubilidad de una subunidad de proteína compleja. Además, se muestra cómo en ensayos de complementación de proteínas in vivo se pueden realizar, y finalmente nos informe sobre el uso de la proteína co-expresión de la frecuencia de mutación sintonizar E. columnayo. Para ello, utilizamos parejas PGOOD-PBAD adecuados para ilustrar ejemplos relevantes de cada estudio de caso.

Protocol

1. Aislamiento de E. coli cotransformantes Preparar las células electro-competente del E. apropiado cepa de E. coli que se transforma. Traslado a 1 ml de medio LB (triptona, extracto de levadura, NaCl a 10, 5, y 10 g / l, respectivamente) de una sola colonia de la cepa de elección, y se incuba a 37 ° C bajo condiciones de agitación de 180 rpm. Diluir el precultivo 1: 500 en 25 ml de medio LB fresco y se incuba el cultivo a 37 ° C. En fase logarítmica (0,6 OD) centrif…

Representative Results

La subunidad ε de E. coli ADN polimerasa III consta de 243 aminoácidos y tiene poca solubilidad 17,18, a menos que se eliminan los residuos 187-243 17. Sin embargo, hemos demostrado que el 11 co-expresión de α de longitud completa, ε y θ subunidades produce ADN polimerasa III soluble núcleo catalítico (Figura 1). En particular, utilizando el sistema de pBAD-PGOOD co-expresión, hemos demostrado que: i) la sobreexpresión de α y ε subunidades puede ser …

Discussion

Las proteínas pueden ser intrínsecamente desordenados, con regiones cuya estructura terciaria no está restringido a un número limitado de conformaciones ^25. Estas proteínas desordenadas son generalmente propensos a la agregación ^25, y su aislamiento y caracterización pueden representar una tarea difícil. La subunidad ε de E. coli DNA polimerasa III tiene dos dominios distintos ^26,27, a saber: i) el dominio N-ter, teniendo la 'actividad exonucleasa 3'-5, y compet…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix