Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Resumo

Neste artigo, é descrito um protocolo para infecção de macrófagos por Cryptococcus neoformans. Além disso, um método para depleção de esteróis dos macrófagos é explicado. Esses protocolos fornecem um guia para estudar infecções fúngicas in vitro e examinar o papel dos esteróis nessas infecções.

Resumo

A criptococose é uma infecção potencialmente fatal causada por fungos patogênicos do gênero Cryptococcus. A infecção ocorre quando da inalação de esporos, que são capazes de replicar no pulmão profundo. A fagocitose por macrófagos de Cryptococcus é uma das formas que a doença é capaz de se espalhar para o sistema nervoso central para causar meningoencefalite letal. Portanto, o estudo da associação entre Cryptococcus e macrófagos é importante para entender a progressão da infecção. O presente estudo descreve um protocolo passo-a-passo para estudar macrófagos infecciosidade por C. neoformans in vitro. Usando este protocolo, o papel de esteróis de acolhimento em interações patógeno-hospedeiro é estudado. Diferentes concentrações de metil - ciclodextrina (MCD) foram usadas para esgotar o colesterol do sarcoma murino retículo semelhantes a macrófagos linha celular J774A.1. Depleção de colesterol foi confirmada e quantificada utilizando tanto um dis comercialmentee kit de colesterol quantificação e cromatografia em camada fina. Células de colesterol empobrecido foram activadas utilizando lipopolissacarídeo (LPS) e interferão gama (IFNy) e infectados com opsonizadas com anticorpos Cryptococcus neoformans de tipo selvagem em células H99 uma razão efector-para-alvo de 1: 1. As células infectadas foram monitorados após 2 horas de incubação com C. neoformans e seu índice fagocitário foi calculado. Depleção de colesterol resultou numa redução significativa do índice de fagocitose. Os protocolos apresentados oferecer um método conveniente para imitar o início do processo de infecção em ambiente de laboratório e estudar o papel da composição lipídica alojamento na infectividade.

Introdução

A fagocitose é um processo pelo qual as entidades extracelulares são internalizados pelas células hospedeiras. É uma arma fundamental no arsenal do sistema imunológico para se defender contra patógenos, mas o processo pode muitas vezes ser subvertida por patógenos para permitir a internalização e se espalhando por todo o corpo ^1. A fagocitose é mediada por vários eventos de sinalização que resultam em anexo e imersão através de rearranjos do citoesqueleto da célula hospedeira. Fagócitos "profissionais" são capazes de reconhecer e ligar-se a opsoninas sobre a superfície do agente patogénico invasor para sinalizar para a ligação e a formação de lamelip�ios....

Protocolo

1. Colesterol depleção de células J774A.1 com MβCD

1. Em uma cabine de segurança biológica estéril, sementes células tipo macrófagos J774A.1 ⁵ 10 por poço numa placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ O / N.
2. Remover mídia da monocamada de células e lava-se as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) que foi filtrado e autoclavado.
3. Adicionar 200 ul de solução MβCD na concentração desejada (10 mM mM ou 30 em PBS) ou 1x PBS co....

Resultados

Colesterol Esgotamento

Análise do sobrenadante reservado no passo 1.3 do protocolo, seguindo as instruções do fabricante no kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red produz uma concentração elevada de colesterol na amostra MβCD tratados em comparação com o controlo de PBS 1x. Dependendo do tipo de célula e a depleção de colesterol concentração MβCD utilizada pode variar. Para J774 tratados com 10 mM de MβCD, foi observada uma diminuição de aproximadamente 50%. A depleção pode ser calculado utiliza.......

Discussão

Ao trabalhar com este protocolo é importante para obter a contagem de células precisos ao cultivo de células de mamíferos e opsonizantes C. células neoformans. Isto minimiza a variação entre ensaios e garante uma precisas 1: 1 de alvo da razão efector ao longo do estudo. Também é crítico para coordenar o momento da depleção de colesterol e para prevenir a infecção das células de levedura ou células opsonizadas macrófagos tratados de repouso à temperatura ambiente entre os processos. Longos períodos de .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gabinete de Biossegurança Classe II tipo A2	Labconco	3460009
Linha celular J774A.1	ATCC	TIB-67	Chega congelado. Consulte as instruções do ATCC para cultura.
Dulbecco' s Modified Eagle Medium Gibco		11995-065	Loja em 4 ° C e quente a 37 &graus; C antes de usar
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus	Gibco	10082-147	Mantenha congelado a -20 ° C e descongele antes de adicionar ao DMEM
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	Usado para complementar a
incubadora de cultura de células DMEM Isotemp	Modelo Fisher Scientific		# 3530
Prato de cultura de 96 poços	Corning Inc. Costar	3595
10x Phosphate Buffered Saline Fisher	Scientific BioReagents	BP3994	Diluir para 1x e filtrar ou autoclave antes de usar.
Metil-β-ciclodextrina	Sigma Life Science	C4555-10G	Dissolver em 1x PBS para fazer soluções de concentrações de 10 mM e 30 mM
Agitador orbital	Labline
Amplex Red	Technologies Sondas Moleculares	A12216	Todos os reagentes para Ensaio de Colesterol estão contidos no kit. Siga as instruções do fabricante.
Placa de ensaio preta de 96 poços	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax leitor de microplacas	Molecular Devices		Modelo F5
Câmara TLC	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	650498-4L
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC Paper	Whatman	3030917	Corte no tamanho necessário para o tanque TLC
Exaustor			Qualquer exaustor que esteja em conformidade com os padrões AIHA/ANSI
Placa de 6 poços	Corning Inc. Costar	3506
Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054
Raspador de células	Corning Inc. Costar	3010
Hemocitômetro	Hausser Scientific	1490
Centrífuga	Beckman Coulter		Modelo Alegra x-30R
Misturador Votex	Fisher Scientific	12-812
Balance	Mettler Toledo		Modelo # MS104S mede até 0,1 mg
Pipeta Glass Pasteur	Fisherbrand	13-678-20A
Colesterol	Avanti Polar Lipids	700000
Concentrador SpeedVac	Thermo Scientific		Modelo # SPD2010
Éter de petróleo	Fisher Scientific	E139-1
Éter dietílico	Sigma-Aldrich	309966
Ácido acético	Sigma-Aldrich	320099
TLC Sílica Gel 60 com zona de concentração	Cromatografia Analítica Millipore	1.11845.0001
Chips de iodo	Sigma-Aldrich	376558-50G
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	320501
Cloreto de manganês	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging	System Ultra-Violet Products Ltd.		Use o software Vision Works LS para análise de densitometria
Prato confocal com fundo de vidro	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			Obtido do Duke University Medical Center
YNB	BD	239210	Consulte o fabricante para obter instruções de preparação. Use uma concentração de glicose de 20 g/L.
Lipopolissacarídeo	Sigma	L4391-1MG	Dissolva em 1x PBS para fazer estoque de 1 mg/ml. Armazene a -20 ° C.
Interferon gama	Sigma	I4777	Dissolva em 1x PBS para fazer 0,1 mg / ml de solução estoque
Anticorpo glucuronoxilomanano (anti-GXM)			Presente do laboratório de Arturo Casadevall A concentração é de 1,98 mg / ml
Giemsa	MP Biomedicals	194591	Dissolva 0,8 g de Giemsa em 25 ml de glicerol e aqueça a 60 ° C por 1 hora. Adicionar 25 ml de metanol à solução e deixar envelhecer à temperatura ambiente durante, pelo menos, 1 mês.
Microscópio	Zeiss		Observer.D1 com AxioCam MRm para tirar imagens

Kit de Ensaio de Colesterol Life