En<em> Ex vivo</em> Modell for å studere Hormone Handling i Human Breast
Summary
Vi har utviklet en ny ex-vivo modell for å studere hormon virkning i det menneskelige bryst. Den er basert på vev mikro isolert fra kirurgiske bryst vevsprøver som bevarer vevet arkitektur, inter interaksjoner, og parakrint signalering.
Abstract
Studiet av hormon virkning i det menneskelige bryst er blitt hindret av mangel på tilstrekkelige modellsystemer. Ved in vitro-kultur, primære bryst epitelceller tendens til å miste hormon-reseptor-ekspresjon. Mye brukt hormon reseptor positiv brystkreft cellelinjer er av begrenset relevans for in vivo situasjon. Her beskriver vi en ex vivo modell for å studere hormon handling i den menneskelige brystet. Friske menneskelige bryst vevsprøver fra kirurgisk kast materiale som reduksjon mammoplasties eller mammectomies er mekanisk og enzymatisk fordøyd å skaffe vevfragmenter inneholder kanaler og lobules og flere stromal celletyper. Disse vev mikro holdt i basal medium uten vekstfaktorer bevare sine inter kontakter, vevet arkitektur, og forbli hormon responsiv i flere dager. De blir lett bearbeidet for RNA og proteinutvinning, histologisk analyse eller lagres i frysemedium. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan brukes for å anrike for spesifikke cellepopulasjoner. Denne protokollen gir en grei, standard tilnærming for translasjonsforskning studier med svært komplekse, varierte menneskelige prøver.
Introduction
Informasjon om mutasjons landskapet i brystkreft er økende på hurtig tempo. Mindre oppmerksomhet har blitt betalt til systemiske faktorer som påvirker brystkreft utvikling. Eksponering for reproduktive hormoner har en stor innvirkning på sykdomsprogresjon 1-3. Likevel er de mekanismer som reproduktive hormoner har betydning for den menneskelige bryst dårlig forstått. Arbeid med genmanipulerte musemodeller har avdekket at de involverer celle egenverdi og parakrine signale gjennom flere nedstrøms effektorer 4.
Den begrensede kunnskap om hormon handling i menneske bryst skyldes i hovedsak mangel på adekvate modeller. Mest arbeid på mekanismene for østrogen reseptor (ER) og progesteron reseptor (PR) signalering har blitt utført med hormonreseptor positive brystkreftcellelinjer, slik som MCF-7 og T47D. Disse ble hentet fra plevravæske fra pasienter med avansert brystkreft som hadde already mottatt flere behandlinger fem. Den biologiske relevansen av funnene i slike enkle in vitro modeller av den menneskelige bryst er tvilsomme og mål gener identifisert i disse in vitro modeller er forskjellig fra mål gener som er identifisert i dyremodeller 6. Når primære humane bryst epitelceller dyrket in vitro har de en tendens til å miste hormon reseptor ekspresjon og derved hormonrespons 7,8. Dette problemet kan circumventd av avanserte 3D-tilnærminger som bruker matrigel. På denne måten, C. Clarke og kolleger klart å etablere bryst epitelceller som beholdt hormon reseptor ekspresjon og viste en proliferativ respons på stimulering progesteron 9. Likevel, to viktig in vivo progesteron reseptor målgener, Wnt-4 og RANKL, ble ikke indusert på progesteron stimulering i dette systemet 9. Denne tilnærmingen ble nylig tatt på videre med in vitro </em> hormon forbehandling og RANKL induksjon ble oppnådd 10. En forbeholdet er fortsatt at matrigel har aktiviteter som er batch-avhengige, er dyrt, og krever en eksperimentell design som er egnet for små cellenummere.
Basert på erfaring av at in vivo ER og PR signale er i stor grad formidlet av paracrine interaksjoner 11, hevdet vi at inter interaksjoner må opprettholdes. En annen viktig faktor som er tapt som vev er dissosiert til enkeltceller for in vitro kultur er interaksjoner av epitelceller med den ekstracellulære matrise; men disse er kritiske for epitelial differensiering og deres avbrudd er viktig i 12 tumorigenesis. Med dette i bakhodet, har vi etablert en metode for å isolere bryst vev mikrostrukturer fra fersk kirurgisk kast materiale 13. Brystet parenchyma, som består av en to-lags epitel med indre og ytre luminal myoepithelial-celler, blir dissekert vekk fra fettvev og utsettes for mekanisk og enzymatisk dissosiasjon. Etter vasking og sentrifugering, er fragmenter av melkekanalene erholdt som beholder nære interaksjoner med mange stromale celler. Disse vev mikro forbli hormon responsiv. Modellen ble validert i kliniske prøver 13. Som sådan kan den foreliggende fremgangsmåte bidrar til å studere hormon virkning i bryst i en biologisk og klinisk relevant sammenheng.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo kultur beskrevet her gir brystvev mikrostrukturer som inneholder intakte kanaler og lobules, sammen med andre celletyper som normalt finnes i den menneskelige kvinnelige bryst. Ved behandling av den menneskelige brystvevet vanligvis oppnådd fra reduksjons mammoplasties, fjerning av fettvev, mekanisk og enzymatisk fordøyelse av stromal matriks og lysering av røde blodceller beriker for melkekanal fragmenter og terminal ductal lobular enheter. Lett enzymatisk fordøyelse til rett konsentrasjon, for ret…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker M. Fiche av Universitetssykehuset i Lausanne for å gi mammoplasty fotografi, M. Wirth og A. Ayyanan av sveitsiske Institutt for eksperimentell kreftforskning, nasjonalt kompetansesenter i forskning Molecular Oncology, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne for teknisk assistanse og R. Clarke fra University of Manchester for kritiske kommentarer. Forskningen fører til disse resultatene har fått støtte fra SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531817, og den Innovative Medicines Initiative fellesforetaket i henhold til tilskuddsavtalen no. 115 188, ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) og European Federation of Pharmaceutical Industries og Foreninger selskapenes tingsinnskudd. Webadressen of Innovative Medicines Initiative er http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
Referências
- Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
- MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
- Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. ‘Hormonal’ risk factors, ‘breast tissue age’ and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
- Brisken, C., O’Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
- Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
- Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
- Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
- Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
- Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
- Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
- Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
- Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
- Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).
