الكشف عن Exosomal العلامات البيولوجية التي يسببها الميدانية الكهربائية الإصدار والقياس (EFIRM)
Summary
Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Abstract
Exosomes والهياكل صغير الحويصلات التي تلعب دور الوسيط في الاتصالات بين الخلايا. ومن مصلحة لدراسة البضائع الداخلية للexosomes لتحديد ما إذا كانت تحمل مرض المؤشرات الحيوية التمييزية. لأداء تحليل exosomal، فمن الضروري وضع طريقة لاستخراج وتحليل exosomes من biofluids الهدف دون الإضرار المحتوى الداخلي.
الإفراج الكهربائية الناجم عن الميدان والقياس (EFIRM) هي طريقة لاستخراج تحديدا exosomes من biofluids، تفريغ حمولتها، واختبار داخلي المحتوى RNA / البروتين. باستخدام CD63 محددة الأجسام المضادة microparticle المغناطيسي مكافحة الإنسان، وعجلت exosomes أول من biofluids. وتطبق التالية الاستخراج، ذات الجهد المنخفض الموجات مربع دوري الكهربائية (CSW) لتعطيل الغشاء الحويصلي وتسبب تفريغ البضائع. والمهجنة محتوى exosome إلى الاشعال DNA أو الأجسام المضادة يجمد على سطح القطب للغنى عنهntification من المحتويات الجزيئي.
طريقة EFIRM هو مفيد لاستخراج exosomes والبضائع تفريغ للتحليل دون تحلل العازلة. هذا الأسلوب هو قادرة على أداء كشف معين من كل من RNA والبروتين العلامات البيولوجية أهداف في exosome. EFIRM مقتطفات exosomes تستند بشكل خاص على علامات سطحها بدلا من التقنيات المعتمدة على الحجم.
المجهر انتقال الإلكترون (TEM) والفحص تبين وظيفة طريقة لالتقاط exosome والتحليل. تم تطبيق طريقة EFIRM إلى exosomal تحليل 9 الفئران المحقونة مع رئة الإنسان خلايا H640 السرطان (خط الخلية transfected للتعبير عن علامة exosome البشري CD63-GFP) من أجل اختبار الشخصية exosome ضد 11 الفئران تلقي الضوابط المالحة. وعثر على مستويات مرتفعة من المؤشرات الحيوية exosomal (المرجع GAPDH الجينات والبروتينات السطحية علامة البشري CD63-GFP) لH640 حقن الفئران في كل من المصل واللعاب العينات. وعلاوة على ذلك، ساليوقد أثبتت فا وعينات المصل لديك الخطي (R = 0.79). هذه النتائج توحي للبقاء المؤشرات الحيوية exosome اللعابية للكشف عن الأمراض البعيدة.
Introduction
البحث Exosome هو المجال الناشئ من التحقيق الذي يدرس microvesicles الدهون التي تحمل RNA 1، 2 DNA، والبروتين 3 البضائع. وقد أدت التحقيقات السابقة من exosome الأحياء لتحديد exosomes في biofluids مثل الدم 4، 5 البول وحليب الثدي 6، واللعاب 7. وقد أثبتت الدراسات أن exosomes تلعب دورا في مسارات الخلوية المختلفة، التأمل التواصل بين أنظمة مختلفة من الجسم 8 عن بعد. بسبب الدور الذي تلعبه في التواصل بين الخلايا exosomes، والافتراض أنهم قد حزمة أهداف جزيء حيوي (البروتين، RNA، DNA و) المترابطة مع الحالات المرضية. في المختبر 3 والحيوان نموذج تظهر 9 الدراسات لإثبات هذه الفرضية. في التحقيق المحتوى exosomal لاكتشاف العلامات البيولوجية، فمن الضروري وضع منهجية لانتقائية العزلة exosome من biofluids، expulsi يسببهاعلى البضائع من exosomes، وتقدير حجم الجزيئات الحيوية exosome. في نطاق هذا العمل، وسيتم تحديد exosomes كهيكل وجود قطرها حوالي 70-100 نانومتر وتملك سطح علامة CD63.
الباحثون عادة أولا تنقية exosomes بواسطة تنبيذ فائق 10 ثم معالجة المحتوى exosomal من خلال استخدام مجموعات تحلل العازلة. استخدام أساليب تحلل العازلة يتطلب مرات حضانة تتراوح بين دقائق إلى ساعات. هذه العملية قد يحتمل أن تضر البضائع exosome وتؤدي إلى تدهور عينة. على سبيل المثال، اللعاب RNA exosome صدر عن طريق تحلل العازلة في البيئة المحيطة خارج الخلية يمتلك عمر نصف أقل من 1 دقيقة، مما يجعل قياس exosomal RNA بعد تحلل العازلة مهمة صعبة للغاية بدون إضافة الكواشف لتحقيق الاستقرار 11. تأثير مركب مضيفا الكواشف المختلفة للتحلل والاستقرار قد يعرض العوامل التي تعقد وتتداخل مع analyجهاز الأمن والمخابرات من المحتويات exosomal. قد يكون نهجا بديلا مفيدة لتفريغ بسرعة المحتوى exosomal والحفاظ بأمان البضائع لتوصيف.
في هذا العمل، نقترح استخدام حقل كهربائي غير موحدة للإفراج عن المحتوى exosomal. من المعروف أن الحقول الكهربائية لنقل القدرة على استقطاب وتعطيل طبقة ثنائية المادة الدهنية التي تشكل أغشية الخلايا. لدينا العمل التجريبي يستكشف استخدام موجات مربع دوري غير موحدة (CSW) لتعطيل البنية microvesicle من exosomes والإفراج عن البضائع المنقولة. وتستخدم هذه الطريقة الفولتية في عدة مئات من مجموعة الميليفولت، وهذا يعني أن معظم الجزيئات الحيوية لن يعرقلها. علينا أن نبرهن على استخدام موجة دوري مربعا قادر على تحفيز إطلاق سراح اللعابية exosome المحتوى مرنا في البيئة المحيطة الموائعية. تم دمج هذا الإصدار من المحتويات exosomal بسلاسة مع نظام الكهربائي التي يمكن استخدامها لقياس مستويات التعبير العلامات البيولوجية 12،13. وتسمح هذه الطريقة المقترحة لالسريع، حساسة، وتحلل العازلة تحليل خالية من المحتوى exosome.
الشكل 1. نظرة عامة على EFIRM سير العمل. وينقسم طريقة EFIRM على نطاق واسع في المراحل الرئيسية الثلاث التي هي ضرورية لتنقية وتحليل exosomes.
ويستخدم هذا استنادا الإفراج المحتوى exosomal وتحليل طريقة لجنة وضع المرأة بالتعاون مع ميكروبيدات CD63 محددة المغناطيسية لexosome العزلة. هذه الخرز CD63 تقارب تسمح لعزل انتقائية من exosomes من عينات اللعابية (وbiofluids أخرى). وبعد حضانة واستخراج exosomes باستخدام الخرز الممغنطة، يتم ترحيل حبات إلى نظام الاستشعار الكهروكيميائية للجنة وضع المرأة استنادا الإفراج المحتوى وتحليل جزء من التجربة. الشكل 1 لمحة عامة عن عملتدفق طريقة EFIRM.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما تشير النتائج، CD63 مكافحة الإنسان المغلفة الجسيمات النانوية المغناطيسية هي قادرة على التقاط تحديدا الجسيمات الصغيرة التي لديها حجم تتراوح 70-100 نانومتر. هذه الجسيمات القبض يتسق مع الملف الشخصى لوحظ سابقا من exosomes. وعلاوة على ذلك، يظهر الاستخدام للجنة وضع المرأة ذات …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المركز الوطني للبحوث الموارد والمركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم والمعاهد الوطنية للصحة، من خلال منحة UL1TR000124 (لFW)؛ فيليكس وميلدريد ييب هبوا الأستاذية وصندوق العائلة بارنز (لDTWW)، والمعهد الوطني طب الأسنان والجمجمة البحوث في المعاهد الوطنية للصحة تحت بجائزة عدد T90DE022734 (لMT). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
Referências
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
- Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
- Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
- Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
- Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
- Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
- Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
- Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
