Påvisning af Exosomal Biomarkør af elektrisk felt-induceret frigivelse og måling (EFIRM)

Summary

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Abstract

Exosomer er microvesicular strukturer, der spiller en rolle som mægler intercellulære kommunikation. Det er af interesse at studere den interne last af exosomer at afgøre, om de bærer sygdoms diskriminerende biomarkører. Til udførelse exosomal analyse er det nødvendigt at udvikle en metode til ekstraktion og analyse af exosomer fra target Biofluids uden at beskadige den interne indhold.

Elektrisk felt-induceret frigivelse og måling (EFIRM) er en metode til specifikt at udtrække exosomer fra Biofluids, losse deres last, og teste deres interne indhold RNA / protein. Anvendelse af et anti-humant CD63-specifikt antistof magnetisk mikropartikel er exosomer først udfældet fra Biofluids. Efter ekstraktion lav spænding elektriske cykliske firkantede bølger (CSW) anvendes til at forstyrre den vesikulær membran og forårsage losning gods. Indholdet af exosomet hybridiseres til DNA-primere eller antistoffer immobiliseret på en elektrode overflade til quantification molekylær indhold.

Den EFIRM fremgangsmåde er fordelagtig til ekstraktion af exosomer og losning lasten til analyse uden lysisbuffer. Denne metode er i stand til at udføre specifik påvisning af både RNA og protein biomarkør mål på exosomet. EFIRM ekstrakter exosomer specifikt baseret på deres overflademarkører i modsætning til størrelse teknikker.

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og assay påvise funktionaliteten af ​​fremgangsmåden til exosom opsamling og analyse. Den EFIRM metode blev anvendt til exosomal analyse af 9 mus injiceret med human lung cancer H640 celler (en cellelinie transficeret til at udtrykke exosomet markør human CD63-GFP) for at teste deres exosome profil mod 11 mus, der modtog saltvand kontrol. Forhøjede niveauer af exosomal biomarkører (henvisning gen GAPDH og protein overflademarkør human CD63-GFP) blev fundet for H640 injicerede mus i både serum og spytprøver. Endvidere SallVA og serumprøver blev påvist at have linearitet (R = 0,79). Disse resultater er tankevækkende for levedygtighed spyt exosom biomarkører til detektering af distale sygdomme.

Introduction

Exosome forskning er en nye inden for undersøgelse, der undersøger lipid mikrovesikler der bærer RNA ^1, DNA ^2, og protein ³ last. Tidligere undersøgelser af exosom biologi har ført til identifikation af exosomer i Biofluids såsom blod ^4, urin ^5, modermælk ^6, og spyt ^7. Undersøgelser har vist, at exosomer spiller en rolle i forskellige cellulære veje, fjernt meditere kommunikation mellem forskellige systemer i kroppen ^8. På grund af den rolle exosomer spille i intercellulære kommunikation er det en hypotese, at de kan pakke biomolekylære mål (protein, RNA og DNA) korreleret med sygdomstilstande. In vitro ³ og dyremodel ⁹ undersøgelser synes at bekræfte denne hypotese. Ved at undersøge exosomal indhold til biomarkør opdagelse, er det nødvendigt at udvikle en metode til selektiv exosom isolation fra Biofluids, induceret expulsipå af gods fra exosomer, og kvantificering af exosom biomolekyler. I omfanget af dette arbejde, vil exosomer defineres som en struktur, der har en diameter på ca. 70-100 nm og besidder overflade markør CD63.

Forskere typisk først rense exosomer ved ultracentrifugering ¹⁰ og så behandle exosomal indhold gennem brugen lysisbuffer kits. Anvendelse lysisbuffer metoder kræver inkubationstider i området fra minutter til timer. Denne proces kan potentielt skade exosom fragt og føre til prøve nedbrydning. For eksempel spyt exosome RNA frigivet via lysis buffer i det omgivende ekstracellulære miljø har en halveringstid på under 1 minut, hvilket gør måling af exosomal RNA post-lysepuffer en særlig vanskelig opgave uden tilsætning af stabiliserende reagenser ^11. Den sammensatte virkning af tilsætning af forskellige reagenser til lysis og stabilisering kan indføre midler, der komplicerer og interfererer med anasis af exosomal indhold. En alternativ fremgangsmåde kan være nyttige for hurtigt losning exosomal indhold og sikkert bevare lasten til karakterisering.

I dette arbejde, foreslår vi brugen af ​​en ikke-ensartet elektrisk felt for frigivelse af exosomal indhold. Elektriske felter er kendt for at bære evnen til at polarisere og forstyrre lipiddobbeltlag, der danner cellemembraner. Vores eksperimentelle arbejde udforsker brugen af ​​uensartede cykliske firkantede bølger (CSW) for at forstyrre mikrovesikel struktur exosomer og frigivelse gennemført fragt. Denne metode anvender spændinger i flere hundrede millivolt interval, hvilket betyder, at de fleste biomolekyler ikke vil blive afbrudt. Vi viser, at brugen af ​​en cyklisk-firkantbølge er i stand til at aktivere frigivelsen af ​​spyt exosome mRNA indhold i det omgivende fluide miljø. Denne udgave af exosomal indhold er integreret med en elektrode, der kan bruges til at kvantificere biomarkør ekspressionsniveauer ^12,13.. Den foreslåede metode giver mulighed for hurtig, følsom, og lysis buffer gratis analyse af exosome indhold.

Figur 1. Oversigt over EFIRM ^Workflow.. The EFIRM metode groft inddeles i tre hovedfaser, der er nødvendige til rensning og analyse exosomer.

Denne CSW baseret exosomal indhold frigivelse og analysemetode bruges sammen med CD63-specifikke magnetiske mikroperler til exosome isolation. Disse CD63-affinitetsperler mulighed for selektiv isolering af exosomer fra spyt prøver (og andre kropsvæsker). Efter inkubering og ekstraktion af exosomer under anvendelse af de magnetiserede perler, er perlerne migreret til den elektrokemiske sensor system for CSW baseret indhold frigivelse og analyse del af forsøget. Figur 1 giver en oversigt over det arbejde,flow af EFIRM metoden.

Protocol

1. magnetisk perle-baserede exosome Extraction Pipette en godt blandet opløsning af 5 pi streptavidin-coatede magnetiske mikropartikler i 495 pi phosphatpufret saltvand (PBS) buffer i et mikrocentrifugerør at resuspendere perlerne. Vask og resuspender perlerne med 500 pi PBS tre gange under anvendelse af en magnetisk rack. Stativet er en vifte af magneter på siden af ​​en boligenhed, der kan holde prøven mikrocentrifugerør. For hver vask, først lade rørene sidde på rack til 1 min, og dere…

Representative Results

Validering af exosome Capture af perler Brug TEM Isolering af exosomer fra spyt under anvendelse af anti-humane CD63 magnetiske perler blev valideret efter ekstraktion protokol ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeder. TEM viser magnetiske perler med 70-100 nm granulat umiddelbart tilstødende (se figur 3A og 3B), i overensstemmelse med den kendte profil exosomer. Ingen 70-100 nm granuler blev observeret for de magnetiske…

Discussion

Som resultaterne indikerer, anti-human CD63 coatede magnetiske nanopartikler er i stand til specifikt at fange små partikler, der har en størrelse i intervallet fra 70 til 100 nm. Dette fanget partikel er i overensstemmelse med den tidligere observerede profil exosomer. Desuden er brugen af ​​lav spænding CSW efter indfangning af partiklerne vist at fjerne dem fra perleoverfladen og forårsage DNA-nedbrydning profiler svarende til en traditionel metode lysepuffer til fragt frigivelse. Disse data tyder på, at arb…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrapure Distilled Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3M KcL Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Germany	11426346910
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, Usa	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, USA	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532