इलेक्ट्रिक फील्ड प्रेरित रिलीज और मापन (EFIRM) द्वारा Exosomal biomarker की जांच
Summary
Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Abstract
Exosomes कहनेवाला संचार में एक mediating भूमिका निभाते हैं कि microvesicular संरचनाओं हैं। यह वे रोग भेदभावपूर्ण बायोमार्कर ले जाने के लिए तय अगर exosomes की आंतरिक कार्गो अध्ययन करने के लिए ब्याज की है। Exosomal विश्लेषण प्रदर्शन के लिए, यह निकालने और आंतरिक सामग्री को नुकसान पहुँचाए बिना लक्ष्य biofluids से exosomes का विश्लेषण करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए आवश्यक है।
बिजली के क्षेत्र प्रेरित जारी है और माप (EFIRM) विशेष रूप से, biofluids से exosomes निकालने उनके माल उतारने, और उनके आंतरिक आरएनए / प्रोटीन सामग्री के परीक्षण के लिए एक विधि है। एक विरोधी मानव CD63 विशिष्ट एंटीबॉडी चुंबकीय microparticle का प्रयोग, exosomes पहले biofluids से उपजी हैं। निम्नलिखित निकासी, कम वोल्टेज बिजली के चक्रीय वर्ग तरंगों (CSW) vesicular झिल्ली को बाधित और माल उतराई पैदा करने के लिए लागू कर रहे हैं। exosome की सामग्री योग्यता के लिए एक इलेक्ट्रोड सतह पर स्थिर डीएनए प्राइमरों या एंटीबॉडी संकरित हैआणविक सामग्री के ntification।
EFIRM विधि lysis बफर के बिना विश्लेषण के लिए exosomes की निकासी और उतराई कार्गो के लिए लाभदायक है। इस विधि exosome में दोनों शाही सेना और प्रोटीन बायोमार्कर लक्ष्यों की विशिष्ट पहचान प्रदर्शन करने में सक्षम है। आकार-आधारित तकनीकों के लिए विरोध के रूप में EFIRM विशेष रूप से उनकी सतह मार्करों के आधार पर exosomes निकालता है।
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) और परख exosome को पकड़ने और विश्लेषण के लिए विधि की कार्यक्षमता प्रदर्शित करता है। EFIRM विधि मानव फेफड़ों के कैंसर H640 कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ 9 चूहों का विश्लेषण खारा नियंत्रण प्राप्त करने के 11 चूहों के खिलाफ उनके exosome प्रोफ़ाइल का परीक्षण करने के क्रम में (exosome मार्कर मानव CD63-GFP व्यक्त करने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट एक सेल लाइन) exosomal करने के लिए लागू किया गया था। Exosomal बायोमार्कर का ऊंचा स्तर (संदर्भ जीन GAPDH और प्रोटीन सतह मार्कर मानव CD63 GFP) H640 दोनों सीरम और लार के नमूनों में चूहों इंजेक्शन के लिए पाए गए। इसके अलावा, सालीवीए और सीरम नमूनों रैखिकता (आर = 0.79) के लिए प्रदर्शन किया गया। इन परिणामों से बाहर रोगों का पता लगाने के लिए लार exosome बायोमार्कर की व्यवहार्यता के लिए विचारोत्तेजक हैं।
Introduction
Exosome अनुसंधान शाही सेना 1, डीएनए 2, और प्रोटीन तीन माल ले कि लिपिड microvesicles परख होती है कि जांच का एक उभरता हुआ क्षेत्र है। Exosome जीव विज्ञान का पिछला जांच जैसे रक्त 4, मूत्र 5, मां के दूध 6, और लार के रूप में 7 biofluids में exosomes की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है। अध्ययन दूर से शरीर 8 की विभिन्न प्रणालियों के बीच संचार ध्यान, exosomes अलग सेलुलर रास्ते में एक भूमिका निभा कि प्रदर्शन किया है। भूमिका का exosomes कहनेवाला संचार में खेलने की वजह से, यह है कि वे रोग राज्यों के साथ सहसंबद्ध बायोमोलिक्यूल लक्ष्य (प्रोटीन, आरएनए, और डीएनए) पैकेज हो सकता है कि धारणा है। इन विट्रो 3 और पशु मॉडल 9 अध्ययनों से इस परिकल्पना की पुष्टि करने के लिए दिखाई देते हैं। बायोमार्कर की खोज के लिए exosomal सामग्री की जांच में, यह biofluids से चयनात्मक exosome अलगाव के लिए एक पद्धति को विकसित करने के लिए आवश्यक है, प्रेरित expulsiexosomes से कार्गो, और exosome biomolecules के गुणात्मक रूप से पर। इस काम की हद में, exosomes एक संरचना लगभग 70-100 एनएम के एक व्यास होने और सतह मार्कर CD63 रखने के रूप में परिभाषित किया जाएगा।
शोधकर्ताओं आम तौर पर पहले ultracentrifugation 10 से exosomes शुद्ध और फिर lysis बफर किट के उपयोग के माध्यम से exosomal सामग्री की प्रक्रिया। Lysis बफर विधि के प्रयोग मिनट से घंटे से लेकर ऊष्मायन बार की आवश्यकता है। इस प्रक्रिया को संभावित exosome कार्गो नुकसान और गिरावट नमूना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, आसपास के बाह्य वातावरण में lysis बफर के माध्यम से जारी की लार exosome शाही सेना exosomal आरएनए के बाद सेल का माप स्थिरीकरण अभिकर्मकों 11 के अलावा बिना एक विशेष रूप से कठिन कार्य बफर बनाने, एक मिनट के तहत की एक आधा जीवन पास। सेल और स्थिरीकरण के लिए विभिन्न अभिकर्मकों जोड़ने के जटिल प्रभाव उलझा कि एजेंट को शुरू करने और analy साथ हस्तक्षेप कर सकते हैंexosomal सामग्री की बहन। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण तेजी exosomal सामग्री उतारने और सुरक्षित रूप से लक्षण वर्णन के लिए कार्गो के संरक्षण के लिए उपयोगी हो सकता है।
इस काम में, हम exosomal सामग्री की रिहाई के लिए एक गैर वर्दी बिजली के क्षेत्र के उपयोग का प्रस्ताव है। इलेक्ट्रिक क्षेत्रों फूट डालना और कोशिका झिल्ली कि रूपों लिपिड bilayer को बाधित करने की क्षमता ले जाने के लिए जाने जाते हैं। हमारे प्रयोगात्मक कार्य exosomes की microvesicle संरचना में खलल न डालें और किए कार्गो रिहा करने के लिए गैर वर्दी चक्रीय वर्ग तरंगों (CSW) के उपयोग की पड़ताल। इस विधि सबसे जैवअणुओं बाधित नहीं किया जाएगा जिसका अर्थ है कि कई सौ millivolt रेंज में voltages के उपयोग करता है। हम एक चक्रीय-वर्ग की लहर के उपयोग के आसपास के fluidic वातावरण में लार exosome mRNA के सामग्री की रिहाई उकसाना करने में सक्षम है कि प्रदर्शित करता है। Exosomal सामग्री की इस रिलीज को मूल बायोमार्कर अभिव्यक्ति के स्तर यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक इलेक्ट्रोड प्रणाली के साथ एकीकृत है 12,13। इस प्रस्तावित विधि exosome सामग्री का तेजी से, संवेदनशील, और lysis बफर मुक्त विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।
EFIRM कार्यप्रवाह के 1. अवलोकन चित्रा।। EFIRM विधि मोटे तौर पर सफ़ाई और विश्लेषण exosomes के लिए जरूरी हैं कि तीन प्रमुख चरणों में बांटा गया है।
इस CSW आधारित exosomal सामग्री रिहाई और विश्लेषण विधि exosome अलगाव के लिए CD63-विशिष्ट चुंबकीय microbeads के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है। ये CD63-आत्मीयता मोती लार के नमूने (और अन्य biofluids) से exosomes के चुनिंदा अलगाव के लिए अनुमति देते हैं। ऊष्मायन और चुम्बकीय मोती का उपयोग exosomes की निकासी के बाद, मोती 1 चित्रा। सामग्री जारी है और प्रयोग के विश्लेषण के भाग के आधार CSW के लिए विद्युत सेंसर प्रणाली के लिए चले गए काम के एक सिंहावलोकन देता रहे हैंEFIRM विधि का प्रवाह।
Protocol
Representative Results
Discussion
परिणामों से संकेत मिलता है के रूप में, मानव विरोधी CD63 लेपित चुंबकीय नैनोकणों विशेष रूप से 70-100 एनएम से लेकर एक आकार है कि छोटे कणों पर कब्जा करने में सक्षम हैं। इस पर कब्जा कर लिया कण exosomes के पहले मनाया प्रोफ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र और (परिवार कल्याण) के लिए अनुदान UL1TR000124 के माध्यम से translational विज्ञान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा समर्थित किया गया था; फेलिक्स और मिल्ड्रेड भौंकना संपन्न प्रोफेसरशिप और (DTWW करने के लिए) बार्न्स परिवार फंड (एमटी) अवार्ड संख्या T90DE022734 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के चिकित्सकीय और Craniofacial अनुसंधान के राष्ट्रीय संस्थान। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
Referências
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