Summary

Обнаружение Exosomal Biomarker электрическим полем индуцированного выбросов и измерений (EFIRM)

Published: January 23, 2015
doi:

Summary

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Abstract

Экзосомы являются мелкопузырчатые структуры, которые играют роль посредника в межклеточной коммуникации. Она представляет интерес для изучения внутреннего груз экзосом, чтобы определить, если они имеют заболевания дискриминационных биомаркеров. Для проведения анализа exosomal, необходимо разработать метод для извлечения и анализа экзосомы из целевых biofluids без повреждения внутреннего содержания.

Электрическое поле, индуцированный выброс и измерение (EFIRM) является метод специально для извлечения экзосомы от biofluids, разгрузка свой груз, и проверка их внутреннее содержание РНК / белок. Использование анти-CD63 человека специфическое антитело магнитного микрочастицы, экзосомы сначала осаждают из biofluids. После экстракции низковольтные электрические циклические прямоугольные волны (РКС) применяются для разрушения везикулярного мембрану и вызывать выгрузки груза. Содержание экзосома гибридизуют с праймерами ДНК или антител, иммобилизованных на поверхности электрода для кваntification молекулярной содержанию.

Метод EFIRM выгодно для извлечения экзосом и разгрузки грузов для анализа без буфера для лизиса. Этот метод может выполнять конкретную обнаружение обеих РНК и белка биомаркеров целей в экзосома. EFIRM извлекает экзосомы специально на основе их поверхностных маркеров, в отличие от методов размера на основе.

Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и анализа свидетельствуют о функциональности метода для захвата и анализа экзосома. Метод EFIRM был применен к exosomal анализ 9 мышей, которым вводили человеческие рака легких H640 клеток (в клеточную линию, чтобы выразить экзосома маркер человек CD63-GFP) для того, чтобы проверить их экзосома профиль против 11 у мышей, получавших управления физиологического раствора. Повышенные уровни exosomal биомаркеров (ссылка ген GAPDH и белка поверхностным маркером человек CD63-GFP) были найдены для H640 вводили мышам в сыворотке и слюны. Кроме того, Салива и образцы сыворотки были продемонстрированы, чтобы иметь линейность (R = 0,79). Эти результаты наводят на размышления для жизнеспособности слюнных экзосом биомаркеров для обнаружения дистальных заболеваний.

Introduction

Экзосома исследования развивающаяся область исследования, которая исследует липидов микровезикулы, которые несут РНК 1, ДНК 2, и белок 3 грузов. Предыдущие исследования экзосома биологии привели к идентификации экзосом в biofluids, таких как кровь 4, мочи 5, грудное молоко 6, слюны и 7. Исследования показали, что экзосомы играют важную роль в различных клеточных путей, удаленно медитации данными между различными системами тела 8. Из-за роли экзосомы играть в межклеточной коммуникации, он предположил, что они могут упаковать биомолекулы целей (белок, РНК и ДНК) коррелирует с болезненными состояниями. В пробирке 3 и животная модель 9 исследования по всей видимости, подтверждают эту гипотезу. При исследовании exosomal контент для поиска биомаркеров, необходимо разработать методологию для селективного выделения экзосома от biofluids, вызванной expulsiна груза из экзосом и количественного экзосом биомолекул. В той степени, в этой работе, экзосомы будут определены как структуру, имеющую диаметр приблизительно 70-100 нм и обладающий поверхностным маркером CD63.

Исследователи, как правило, первый очистки экзосомы ультрацентрифугированием 10, а затем обработать exosomal содержание за счет использования буфера для лизиса комплектов. Использование методов лизис буфера требуется время инкубации, начиная от нескольких минут до нескольких часов. Этот процесс может нанести вред экзосома груз и привести к образцу деградации. Например, слюнные экзосом РНК выпущен с помощью лизирующего буфера в окружающую среду внеклеточного обладает периодом полураспада менее 1 мин, что делает измерение exosomal РНК после буфера для лизиса особенно трудной задачей без добавления реагентов стабилизации 11. Усугубляется эффект от добавления различных реагентов для проведения лизиса и стабилизации может ввести агентов, которые усложняют и вмешиваться в анализ содержания exosomal. Альтернативный подход может быть полезен для быстрого разгрузки содержание exosomal и безопасно сохранении груз для характеризации.

В этой работе, мы предлагаем использование в неоднородном электрическом поле для высвобождения exosomal содержанию. Электрические-поля, как известно, несут способность к поляризации и нарушать липидный бислой, который образует клеточные мембраны. Наша экспериментальная работа исследует использование неоднородных циклических квадратных волн (РКС) за нарушение структуры microvesicle экзосом и освобождение осуществляется груз. Этот метод использует напряжение в диапазоне нескольких сотен милливольт, это означает, что большинство биомолекул не будет нарушена. Показано, что использование циклического-меандра может приводить высвобождение слюнных экзосома содержания мРНК в окружающей текучей среды. Этот выпуск содержимого exosomal интегрируется с системой электродов, которые могут быть использованы для количественной оценки уровней экспрессии биомаркера 12,13. Этот предложенный метод позволяет быстро, чувствительной, и лизис буфера свободного анализа содержания экзосома.

Рисунок 1
Рисунок 1. Обзор EFIRM Workflow.. Метод EFIRM в целом подразделяется на три основных этапа, которые необходимы для очистки и анализа экзосом.

Это метод, основанный релиз и контент-анализ exosomal РКС используется в сочетании с CD63-удельная магнитная микросфер для изоляции экзосома. Эти CD63-сродства бусины позволяют для селективного выделения экзосом из слюнных образцов (и других biofluids). После инкубации и добычи экзосом с использованием намагниченных бусы, бисер, переносятся в электрохимической системе сенсора для РКС на основе релиз контента и анализа часть эксперимента. Рисунок 1 дает общее представление о работетечь метода EFIRM.

Protocol

1. Магнитная бисера на основе экзосома Добыча Пипетки хорошо смешанный раствор 5 мкл покрытых стрептавидином магнитных микрочастиц в 495 мкл фосфатно-солевым буфером (PBS) буфере в микроцентрифужных трубки для ресуспендирования гранул. Промыть и ресуспендируют гранул с 500 мкл PBS три …

Representative Results

Проверка экзосома Capture из бисера с помощью ПЭМ Выделение экзосом из слюны с использованием анти-CD63 человека магнитных шариков было подтверждено в соответствии с протоколом экстракции с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) изображения. ТЕМ пок?…

Discussion

Как показывают результаты, анти-человеческий CD63 покрытием магнитные наночастицы способны специфически захватывать мелкие частицы, которые имеют размер в пределах от 70-100 нм. Это захвачен частиц в соответствии с ранее наблюдаемым профилем экзосом. Кроме того, использование Комиссии по…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным Центром научных ресурсов и Национальным центром для продвижения трансляционных наук, Национальные институты здравоохранения, через гранты UL1TR000124 (до FW); Феликс и Милдред Ип Обладая профессура и фонда семьи Барнс (для DTWW), Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований Национального института здравоохранения в рамках премии номер T90DE022734 (МТ). Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface  Genefluidics, USA  RS-1000-16
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips Genefluidics, USA SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody Ancell, USA 215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Invitrogen, USA 65601
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) K&J Magnetics, USA DH101
Ultrapure Distilled Water Life Technologies, USA 10977-023
Mettler Toldeo 3M KcL Solution Fisher Scientific, USA 1911512
Pyrrole Sigma-Aldrich, USA W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments Roche, Germany 11426346910
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)  Neogen, Usa 330175
Phosphate Buffered Saline Solution Life Technologies, USA 10010023
Casein/PBS Fisher Scientific, USA 37532

Referências

  1. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  2. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
  3. Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
  4. Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
  5. Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
  6. Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
  7. Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
  8. Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  9. Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
  11. Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
  12. Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
  13. Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
  14. Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
check_url/pt/52439?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Tu, M., Wei, F., Yang, J., Wong, D. Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM). J. Vis. Exp. (95), e52439, doi:10.3791/52439 (2015).

View Video