Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)
Summary
Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Abstract
Les exosomes sont des structures microvésiculaire qui jouent un rôle de médiateur dans la communication intercellulaire. Il est intéressant d'étudier la cargaison interne des exosomes pour déterminer si elles sont porteuses de maladies biomarqueurs discriminatoires. Pour effectuer une analyse de exosomal, il est nécessaire de mettre au point un procédé d'extraction et d'analyse des exosomes à partir de fluides biologiques cibles sans endommager le contenu interne.
Libération induite de champ électrique et de mesure (EFIRM) est une méthode pour extraire spécifiquement exosomes de biofluides, le déchargement de leur cargaison, et de tester leur contenu ARN / protéines interne. Utilisation d'un anticorps CD63 spécifique microparticule magnétique anti-humain, les exosomes sont tout d'abord précipités à partir de fluides biologiques. Après extraction, basse tension électriques des ondes carrées cycliques (CCF) sont appliqués à rompre la membrane vésiculaire et provoquer déchargement de marchandises. Le contenu de la exosomes est hybridée à des amorces d'ADN ou des anticorps immobilisés sur une surface d'électrode pour quantification du contenu moléculaire.
Procédé de EFIRM est avantageux pour l'extraction des exosomes et déchargement des marchandises pour l'analyse sans tampon de lyse. Ce procédé est capable de réaliser une détection spécifique de deux cibles d'ARN et de protéines biomarqueurs dans le exosomes. EFIRM extrait exosomes spécifiquement en fonction de leurs marqueurs de surface par opposition à des techniques basées sur la taille.
Microscopie électronique en transmission (TEM) et le dosage montrent la fonctionnalité du procédé de capture et d'analyse des exosomes. Procédé de EFIRM a été appliqué à exosomales analyse de 9 souris injectées avec des cellules H640 de cancer du poumon humain (une lignée cellulaire transfectée pour exprimer le marqueur d'exosomes CD63-GFP humain) afin de tester leur profil d'exosomes contre 11 souris recevant témoins de sérum physiologique. Des niveaux élevés de biomarqueurs exosomales (GAPDH du gène de référence et de la protéine de surface marqueurs humaine CD63-GFP) ont été trouvé pour le H640 souris injectées dans les deux échantillons de sérum et de salive. En outre, saliVA et des échantillons de sérum ont été démontré que la linéarité (R = 0,79). Ces résultats suggèrent pour la viabilité des biomarqueurs salivaires exosomes pour la détection de maladies distales.
Introduction
recherche Exosome est un domaine émergent de l'enquête qui examine microvésicules lipidiques qui portent une ARN, l'ADN 2, 3 et en protéines cargaison. Enquêtes précédentes de la biologie exosomes ont conduit à l'identification des exosomes dans biofluides tels que le sang 4, 5 urine, le lait maternel 6, 7 et la salive. Des études ont démontré que les exosomes jouent un rôle dans différentes voies cellulaires, méditant à distance communication entre les différents systèmes du corps 8. En raison du rôle exosomes jouent dans la communication intercellulaire, on suppose qu'elles peuvent conditionner biomolécules cibles (protéines, ARN et ADN) corrélés à des états pathologiques. 3 in vitro et de l'animal modèle 9 études semblent confirmer cette hypothèse. En recherchant la teneur exosomal pour la découverte de biomarqueurs, il est nécessaire de développer une méthodologie pour l'isolement de exosome sélective de fluides biologiques, expulsi induiteen charge des cargaisons d'exosomes, et la quantification de biomolécules d'exosomes. Dans la mesure de ce travail, les exosomes seront définis comme une structure ayant un diamètre d'environ 70 à 100 nm et possédant surface marqueur CD63.
Les chercheurs généralement abord purifier exosomes par ultracentrifugation 10 puis traiter le contenu exosomal grâce à l'utilisation de kits de tampon de lyse. Utilisation de méthodes de tampon de lyse nécessite des temps d'incubation allant de quelques minutes à quelques heures. Ce processus peut potentiellement nuire fret exosomes et conduire à la dégradation de l'échantillon. Par exemple, un ARN exosomes salivaire libéré par le tampon de lyse dans le milieu extracellulaire entourant possède une demi-vie de moins de 1 min, ce qui rend la mesure de l'ARN exosomal post-Lysis Buffer une tâche particulièrement difficile sans l'addition de réactifs de stabilisation 11. L'effet composé de l'ajout de divers réactifs pour la lyse et la stabilisation peut introduire des agents qui compliquent et interférer avec l'analysis du contenu de exosomal. Une autre approche peut être utile pour décharger rapidement le contenu de exosomal et la préservation de la cargaison en toute sécurité pour la caractérisation.
Dans ce travail, nous proposons l'utilisation d'un champ électrique non-uniforme pour la libération de contenu exosomal. Champs électriques ont été connus pour porter la capacité à polariser et perturber la bicouche lipidique qui forme les membranes cellulaires. Notre travail expérimental explore l'utilisation de non-uniformes ondes carrées cycliques (CSW) pour perturber la structure de microvésicule des exosomes et de libérer la cargaison transportée. Cette méthode utilise des tensions dans la gamme de plusieurs centaines de millivolts, ce qui signifie que la plupart des biomolécules ne seront pas perturbés. Nous démontrons que l'utilisation d'une onde cyclique carré est apte à actionner libération des exosomes salivaires contenu de l'ARNm dans l'environnement fluide environnant. Cette version de la teneur en exosomal est parfaitement intégré avec un système d'électrodes qui peut être utilisé pour quantifier les niveaux d'expression de biomarqueur 12,13. Cette méthode proposée permet sensibles, et le tampon de lyse analyse rapide, sans contenu de exosomes.
Figure 1. Vue d'ensemble de EFIRM Workflow.. La méthode de EFIRM est globalement divisé en trois grandes phases qui sont nécessaires pour la purification et l'analyse des exosomes.
Cette teneur en exosomal libération et l'analyse sur la base de la méthode CSW est utilisé en conjonction avec des microbilles magnétiques spécifiques à CD63 pour l'isolement d'exosomes. Ces billes permettent CD63 affinité pour l'isolement sélectif des exosomes à partir d'échantillons salivaires (et d'autres fluides biologiques). Après incubation et d'extraction des exosomes en utilisant les perles magnétisées, les perles sont migrés vers le système de capteur électrochimique pour la CSW de presse basée contenu et la partie de l'analyse de l'expérience. La figure 1 donne un aperçu du travailse écouler de la méthode de EFIRM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme les résultats l'indiquent, CD63 anti-humain revêtu nanoparticules magnétiques sont capables de capturer spécifiquement les petites particules qui ont une taille allant de 70 à 100 nm. Cette particule capturée est cohérent avec le profil déjà observé des exosomes. En outre, l'utilisation de la CCF basse tension suivant la capture des particules est indiquée pour les retirer de la surface des billes et causer des profils de dégradation d'ADN similaires à celle d'une méthode traditionnel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Center for Research Resources et le Centre national pour l'avancement des sciences translationnelle, National Institutes of Health, par Grant UL1TR000124 (FW); Félix & Mildred Yip Doué chaire et le Fonds famille Barnes (à DTWW), l'Institut national de recherche dentaire et craniofaciale des Instituts nationaux de la santé en vertu Prix Nombre T90DE022734 (MT). Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
Referências
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
- Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
- Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
- Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
- Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
- Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
- Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
- Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
