Helhetlig vurdering av kimbane Chemical Toxicity Bruke Nematode<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
Identifisere reproduksjonstoksiske effekter av de tusenvis av kjemikalier i vårt miljø har vært en av de mest fristende utfordringer innen miljørettet helsevern. Dette er delvis på grunn av det sparsommelige modellsystemer som kan (1) nøyaktig rekapitulere nøkler funksjoner i reproduktive prosesser og (2) gjøre det i en middels til høy gjennomstrømming mote, uten behov for et høyt antall virveldyr.
Vi beskriver her en analyse i nematode C. elegans som tillater hurtig identifisering av germline giftstoffer ved å overvåke induksjon av aneuploide embryoer. Ved å gjøre bruk av et GFP reporter linje, blir feil i kromosom segregering som følge av kimlinje avbrudd lett visualisert og kvantifisert ved automatisert fluorescens mikroskopi. Således screening av et bestemt sett av forbindelser for dets toksisitet kan utføres i et 96- til 384-brønn plate-format i løpet av noen dager. Sekundær analyse av positive hsin kan utføres for å fastslå om kromosomfeil stammer fra meiotisk avbrudd eller fra tidlig fosterdød kromosom segregering feil. Til sammen representerer denne analysen en rask førstepassasje strategi for rask vurdering av kimlinje dysfunksjon etter kjemisk eksponering.
Introduction
Det er ca 87 000 kjemikalier registrert for handel i USA, men bare et fåtall av disse har blitt testet for potensielle helseeffekter 1. Av de som har blitt testet, har bare en del er vurdert for reproduktive helseeffekter på grunn av delvis til vanskelighetene med å bestemme endring av de tidlige reproduktive hendelser i pattedyr, spesielt under kvinnelig bakterie celle utvikling og differensiering. Faktisk, den første meiotisk arrangementer finner sted i løpet av de tidlige stadier av fosterutvikling hos kvinnelige pattedyr, og er derfor vanskelig å få tilgang til og samle inn tall som passer for screening-formål.
Kimlinje gir den viktige sammenheng mellom generasjoner, og dens riktige funksjon er avhengig av den nøyaktige utførelse av den intrikate program av cellulær og kromosomal divisjon betegnet meiose. Dysregulering av meiotisk fremgangsmåte kan resultere i redusert fertilitet og produksjon avkjønnsceller og embryo med et unormalt antall kromosomer, kalles en tilstand Aneuploidy. Kromosom segregering feil i meiose er svært relevant for menneskers helse. Kromosomfeil er vanlige, med en frekvens på 1 i 150 levendefødte, Trisomi 21, 18 og 13 samt X og Y-kromosomfeil blir de mest utbredte typer 2,3. Videre medfødte misdannelser, inkludert de av kromosom opprinnelse, er den ledende årsaken til spedbarnsdød i USA 4 Ideen om at miljømessige påvirkninger kan påvirke kromosomsegregering og atferd er ikke ny 5, men er fortsatt dårlig forstått. Det er derfor viktig å undersøke hvilke av kjemikalier introdusert i vårt miljø er i konflikt med menneskelig fruktbarhet, tidlig utvikling og generell reproduktiv helse.
I lys av disse begrensningene av pattedyr modeller, har vi utviklet en high-throughput skjerm analyse for å teste reproduksjonstoksisitet i rundorm <em> C. elegans. Vi har mobilisert flere viktige funksjoner som tilbys av denne brukte genetiske modellsystem som sin lille størrelse, lave kostnader, kort gjengivelse syklus, høy andel av kjønnsceller og enkel manipulasjon 6. Ormer kan dyrkes i 96-brønners plater eller i høye volum flytende kulturer, og på grunn av sin gjennomsiktighet kan avbildes direkte på platene for deteksjon av fluorescerende pressen. Analysen beskrevet nedenfor tar nytte av disse egenskapene og tar nytte av en orm belastning som inneholder fluorescerende reporter Pxol-1 :: GFP å oppdage kimlinje avbrudd og induksjon av embryonale Aneuploidy.
Bruken av denne reporter-stammen er basert på den generelt sjeldne forekomst av hanner i en hovedsakelig hermaphroditic orm befolkningen. Disse menn (<0,2%) naturlig stamme fra feil i segregering av X-kromosomet 7. Men som kimlinje avbrudd ofte fører til feil i segregering av autosomerog av heterochromosomes, det korrelerer både med en forhøyet forekomst av hanner fenotype (X missegregation) samt embryonale letalitet (autosome missegregation). For enkelt å oppdage induksjon av hanner mens omgå spørsmålet om embryonale dødelighet, er en hann-promoter (xol-1) som brukes til å drive uttrykk for GFP i tidlige embryoer fortsatt finnes i ormen livmor. Som sådan, er fremkomsten av GFP-uttrykk embryoer brukt som en proxy for tilstedeværelse av aneuploide embryoer. Denne fremgangsmåte er tidligere blitt brukt for å identifisere gener involvert i kimlinje vedlikehold og meiose 8,9. Innrettet til kjemisk screening, er denne stammen som anvendes i et medium til høy gjennomstrøming. Viktigere, rapporterer belastningen trofast aneugenicity av kjemikalier og er derfor relevant for pattedyr reproduktive endepunkter 10. Analysen beskrevet her vil være spesielt nyttig for toksikologer i farmasøytisk og kjemisk industri innstillinger jaktfor å vurdere hurtig toksisitet av kjemikalier mot forplantnings endepunkter. Videre denne analysen justert fullt med de statlige prioriteringene fremhevet i Toxicity i det 21. århundre rapport 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåten beskrevet her utgjør det første storskala strategi for identifisering av germline giftstoffer. Det krever bruk av en GFP transgene Pxol-1 :: GFP inneholder stamme som trofast rapporterer induksjon av Aneuploidy i tidlige embryoer som brukes som en proxy for kimlinje dysfunksjon. Fremgangsmåten innebærer imidlertid synkroniseringen av en C. elegans orm befolkning og ormer eksponering for kjemikalier i 96-brønners format fulgt av avbildning av GFP positive ormer og automatisert høy-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
Referências
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genética. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
