मल्टिप्लेक्स अनुप्रयोगों के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जेनेटिक बारकोडिंग
Summary
Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.
Abstract
Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.
Introduction
ऐसे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry के रूप में प्रौद्योगिकी, सभी प्रतिदीप्ति पर भरोसा करते हैं, एक संपत्ति को व्यापक रूप से जैव रासायनिक, जैव चिकित्सा, और रासायनिक अनुप्रयोगों में शोषण किया। प्रतिदीप्ति, आंतरिक या लेबलिंग के माध्यम से, प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न और प्रोफाइल, सेल भाग्य, प्रोटीन बातचीत और जैविक कार्यों 1-9 के विश्लेषण के लिए शोषण किया गया है, और चाहे बायोमोलिक्यूल बातचीत और गठनात्मक परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति / Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के माध्यम से 10-13। Aequorea विक्टोरिया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) 14 के अलगाव के बाद से, अन्य निडारियंस, विशेष रूप से मूंगों से अतिरिक्त प्राकृतिक रूप से उत्पन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन की खोज की है, काफी हद तक अलग पहचाना / उत्तेजना उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ मौजूदा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संख्या बढ़ गई है। ये एक साथ उनके जीनों 15-19 में परिवर्तन की शुरूआत के साथ, हवलदारई आगे उनके अनुसंधान के लिए cytometry और अन्य प्रतिदीप्ति आधारित प्रौद्योगिकियों प्रवाह, माइक्रोस्कोपी का फायदा उठाने कि वैज्ञानिकों के लिए उपलब्ध फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक सच पैलेट प्राप्त करने, संभावनाएं विस्तार किया।
समानांतर में, स्वतंत्र रूप से हालांकि, रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी के विकास के लिए काफी स्तनधारी कोशिकाओं 20-23 में अस्थानिक आनुवांशिक जानकारी के स्थिर अभिव्यक्ति में मदद की है। यह इस प्रौद्योगिकी प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों 24-28 की एक व्यापक संख्या में या ट्रांसजेनिक जानवरों 29-31 के उत्पादन के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का जीन स्थानांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि इस प्रकार आश्चर्य की बात नहीं है। रेट्रोवायरस की प्रकृति के बाद, अस्थानिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के आनुवंशिक जानकारी सेल 32 के जीनोम के भीतर शुरू की है और सेल ever' के लिए `फ्लोरोसेंट हो जाता है। यह गुण सेल भाग्य की ट्रैकिंग की अनुमति दी है, या कोशिकाओं की आबादी के भीतर एक एकल कोशिका की गई है। अब फ्लोरोसेंट सेल इस प्रकार Acqui हैअपनी ही biosignature लाल और barcoded के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। अपनी अनूठी biosignature अन्य कोशिकाओं से इसे पहचानती है, और महत्वपूर्ण बात है, आनुवंशिक रूप से अलग पहचाना अवशोषण / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए चालाकी से कोशिकाओं से अलग करता है। ऐसे pluripotency 33 की ओर reprogramming के कारकों की ट्रैकिंग के रूप में जैविक अनुप्रयोगों, nucleolar स्थानीयकरण 34 की व्याख्या के लिए subnuclear कारकों का विश्लेषण, ट्रांसक्रिप्शनल पढ़ाई 35 या neuronal नेटवर्क वास्तुकला 36 के अध्ययन के लिए न्यूरॉन्स की आनुवंशिक लेबलिंग के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाता plasmids के निर्माण , एक ही प्रयोगात्मक स्थापना के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन का शोषण किया है कि कई के सिर्फ चार उदाहरण हैं।
Cytometry के मोटे तौर पर इस तरह के जीन की अभिव्यक्ति, कोशिका चक्र, apoptosis के रूप में एकल कोशिका के स्तर पर जैविक प्रक्रियाओं, के विश्लेषण के लिए उपयोग किया है, और phosphoryl के माध्यम से संकेत दिया गया है प्रवाहस्तनधारी कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन की व्यावहारिक 37-43 व्याप्ति में स्थिर अभिव्यक्ति आगे सेल विश्लेषण 38,44 और ligand- रिसेप्टर बातचीत 45 के लिए फ्लो की उपयोगिता को बढ़ाया है। क्षमताओं को बढ़ाया cytometry के उच्च throughput और उच्च सामग्री 46 स्क्रीनिंग के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग कार्यप्रणाली बनने के प्रवाह की अनुमति दी है। युगल प्लेट रीडर प्रणाली, इमेजिंग और प्रवाह cytometry कर सकते हैं कि fluorometers और रोबोटिक्स प्रौद्योगिकियों का अब विस्तार संख्या के बावजूद, शोषण और इन बढ़ाया तकनीकी क्षमताओं फिट कर सकते हैं कि प्रयोगात्मक डिजाइन में कमी नहीं हो रहा है।
तेज, विश्वसनीय, सरल और मजबूत सेल आधारित तरीके में काफी आगे उच्च throughput क्षमता बढ़ाने कि मल्टिप्लेक्स अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं। एक मल्टिप्लेक्स प्रारूप में इंजीनियरिंग सेल आधारित assays उच्च throughput स्क्रीनिंग 39,47-50 की शक्ति को बढ़ाने के लिए कर सकते हैं जहां यह दवाओं की खोज के क्षेत्र में विशेष रूप से सच है </sup>। यह एक नमूने में एक साथ विश्लेषण की अनुमति देता है के रूप में बहुसंकेतन, आगे उच्च throughput क्षमताओं 51-54 को बढ़ाता है। फ्लोरोसेंट आनुवंशिक बारकोडिंग सुरुचिपूर्ण बहुसंकेतन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक बार इंजीनियर, समय लेने वाली प्रोटोकॉल की जरूरत circumvents, एंटीबॉडी, माला और दाग 39,52,55 के साथ साथ लागत कम कर देता है, और उच्च के लिए आवश्यक स्क्रीन की संख्या को कम कर सकते हैं न केवल आवेदन throughput। हमने हाल ही में जैविक अनुप्रयोगों के लिए, पहले से विभिन्न चिकित्सकीय प्रचलित वेरिएंट 58 के साथ एचआईवी -1 प्रोटीज गतिविधि 56,57 नजर रखने के लिए विकसित की एक परख व्यक्त फ्लोरोसेंट आनुवंशिक बारकोडिंग के माध्यम से बहुसंकेतन वृद्धि कर सकते हैं कि कैसे रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी का वर्णन किया है। पद्धति का चयन करें और आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट बारकोड वाले कोशिकाओं बढ़ाना और विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन और / या अलग प्रतिदीप्ति intensit व्यक्त प्रतिरूप आबादी के पैनल निर्माण करने के लिए कैसे करने के तरीके पर ध्यान केंद्रित एक और वर्णनात्मक ढंग से समझाया गया हैएँ। उनके फ्लोरोसेंट विशेषताओं के आधार पर अलग पहचाना सेल आबादी के पैनलों आगे विभिन्न जैविक सवालों से निपटने कि सेल आधारित assays के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो मल्टिप्लेक्स क्षमताओं को बढ़ाने। प्रोटोकॉल भी उदाहरण 59 के रूप में, पहले से प्रयोगशाला में विकसित सेल आधारित assays के एक असर बारकोड वाले कोशिकाओं के एक पैनल इंजीनियर कैसे करें। इस प्रोटोकॉल इस प्रकार आनुवंशिक हस्तांतरण के लिए अच्छी तरह से स्थापित रेट्रोवायरल / lentiviral प्रौद्योगिकी, फ्लोरोसेंट प्रोटीन का मूल्य या 60,48 प्रवाह cytometry के आवेदनों को दिखाने के लिए इरादा नहीं है बल्कि मल्टिप्लेक्स अनुप्रयोगों के लिए तीन के संयोजन के बढ़ाने शक्ति दिखाने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ दो अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रियाओं के संयुक्त किया गया है; रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी और प्रवाह cytometry का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के माध्यम से जेनेटिक इंजीनियरिंग। अद्वितीय सेल लाइन?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम रेट्रोवायरल कणों के उत्पादन के लिए फीनिक्स जीपी पैकेजिंग सेल लाइन उपलब्ध कराने के लिए स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय से डॉ गैरी नोलन को धन्यवाद देना चाहूंगा। हम टीडी टमाटर प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया के सैन डिएगो के विश्वविद्यालय में डॉ रोजर Tsien धन्यवाद। हम भी उनकी सेवा और मदद के लिए सैन डिएगो स्टेट यूनिवर्सिटी फ्लो कोर सुविधा को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10mL syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45µm plytetrafluoroethylen filter | pall corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2mg/mL concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5µg/mL concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
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