Genetisk strekkoding med Fluorescent Proteiner for multiplekset Applications

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Teknologier som fluorescens spektroskopi, fluorescens mikroskopi og flowcytometri, alle er avhengige av fluorescens, en eiendom allment utnyttet i biokjemiske, biomedisinske, og kjemiske applikasjoner. Fluorescens, enten iboende eller ved merking, har vært utnyttet for analyse av protein uttrykk mønstre og profiler, celle skjebne, protein interaksjoner og biologiske funksjoner ^1-9, og gjennom fluorescens / Förster resonans energioverføring for påvisning av biomolekyl interaksjoner og konformasjonsendringer ^10-13. Etter isolering av Aequorea Victoria grønt fluorescerende protein (GFP) ^14, oppdagelsen av flere naturlig forekommende fluorescerende proteiner fra andre nesledyrene, særlig koraller, har i stor grad økt antall eksisterende fluorescerende proteiner med skjelnes eksitasjon / emisjonsspektra. Disse, sammen med innføring av mutasjoner i genene ^15-19, have ytterligere utvidet mulighetene, skaffe en ekte palett av fluorescerende proteiner tilgjengelig for forskere som utnytter mikroskopi, flowcytometri og andre fluorescens-basert teknologi for sin forskning.

I parallell, men uavhengig av hverandre, utviklingen av retrovirale teknologi har muliggjort drastisk stabil ekspresjon av ektopisk genetisk informasjon i pattedyrceller ^20-23. Det er derfor ikke overraskende at denne teknologi har blitt brukt for å overføre gener av fluorescerende proteiner inn i en bred rekke celletyper og vev ^24-28 eller for produksjon av transgene dyr ^29-31. Etter arten av retrovirus, er det genetiske informasjon av ektopisk fluorescerende protein innført i genomet av cellen ^32, og cellen blir fluorescerende `for ever'. Denne egenskapen har gjort sporing av celle skjebne, eller av en enkelt celle i en populasjon av celler. Den nå fluorescerende celle har dermed acquirød sin egen BioSignature og kan defineres som strekkode. Sin unike BioSignature identifiserer den fra andre celler, og viktigere, skiller den fra celler genetisk manipulerte til å uttrykke ulike fluorescerende proteiner med identifiserbar absorpsjon / emisjonsspekter. Biologiske applikasjoner som sporing av reprogrammerings faktorer mot pluripotency ^33, analyse av faktorene subnuclear for klarlegging av nukleolært lokaliserings ^34, konstruksjonen av fluorescerende reporter plasmider for transkripsjonelle studier ³⁵ eller den genetiske merking av nerveceller for studiet av neuronal nettverksarkitektur ³⁶ , er bare fire eksempler på de mange som har utnyttet ulike fluorescerende protein gener for samme eksperimentelle oppsettet.

Strømningscytometri er blitt mye brukt for analyse av biologiske prosesser på enkeltcelle-nivå, for eksempel genekspresjon, cellesyklus, apoptose, og signalisering gjennom fosforylasjon ^37-43 sikret stabil uttrykk for fluorescerende protein gener i pattedyrceller har ytterligere forbedret nytten av flowcytometri for celle analyse ^38,44 og ligand-reseptor interaksjoner ^45. Forbedrede evner har lov flowcytometri for å bli en mye brukt metode for høy gjennomstrømming og høy-innhold screening ^46. Til tross for den nå utvidet antall fluorometers og robotikk teknologier som kan par platelesersystemer, bildebehandling og flowcytometri, synes det å være en mangel i eksperimentell design som kan utnytte og tilpasse disse forbedrede teknologiske evner.

Raske, pålitelige, enkle og robuste celle-baserte metoder er drastisk behov for multiplekserte programmer som ytterligere forbedrer høy gjennomstrømming kapasitet. Dette er spesielt tilfelle når det gjelder medisiner hvor konstruksjonscellebaserte assays i en multiplekset format kan øke kraften i high-throughput screening ^39,47-50 </sup>. Multipleksing, som gjør det mulig samtidige analyser i én prøve, forbedrer ytterligere high-throughput evner ^51-54. Fluorescerende genetisk strekkoding gir ikke bare en elegant multipleksing, men også, når konstruert, omgår behovet for tidkrevende protokoller, reduserer kostnader ledsaget med antistoffer, perler og flekker ^39,52,55, og kan redusere antall skjermer som kreves for høy- gjennomstrømning. Vi har nylig beskrevet hvordan retroviral teknologi kan forbedre multiplexing gjennom fluorescerende genetisk barcoding for biologiske applikasjoner, ved å uttrykke en analyse tidligere utviklet for å overvåke HIV-1 protease aktivitet ^56,57 med forskjellige klinisk utbredte variantene ^58. Metodikken er forklart i en mer beskrivende måte å fokusere på hvordan du velger og forsterke genetisk fluorescerende strekkode celler og hvordan å produsere paneler av klonale populasjoner som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner og / eller annen fluorescens intensitetenkaper. Paneler av cellepopulasjoner kan skjelnes fra hverandre på grunnlag av deres fluorescerende egenskaper forbedre multipleksede kapasiteter, som kan videre utnyttes i kombinasjon med cellebaserte assays som håndterer forskjellige biologiske spørsmål. Protokollen beskriver også hvordan man skal konstruere et panel av strekkode- celler som bærer en av de cellebaserte assays som tidligere er utviklet i laboratoriet, som i eksempel ^59. Denne protokollen er således ikke ment å vise den veletablerte retroviral / lentiviral teknologi for genetisk overføring, verdien av fluorescerende proteiner eller anvendelser av flowcytometri ^60,48, men i stedet for å vise den styrke kraft for å kombinere de tre for multipleksede anvendelser.

Protocol

1. Fremstilling av pattedyrceller, virusproduksjonen og Transduksjon for Genetic strekkoding Plate 2,5 x 10 6 adherente celler i en 10 cm plate (eller rundt 50 til 60% konfluens) en dag før transfeksjon i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 10% føtalt kalveserum (FCS). For retroviral bruk produksjon emballasje celle-linje av valg som Phoenix-GP (en slags gave fra Gary Nolan, Stanford University). MERK: Emballasjen cellelinje stabilt uttrykker Gag og Pol proteiner for retroviral p…

Representative Results

Multipleksing fluorescerende genetisk strekkode celler for formålet av biologiske anvendelser kan bare oppnås når de enkelte klonale populasjoner er blitt generert. Multipleksing er mest effektiv når strekkode populasjoner har klare distinkte fluorescerende egenskaper med minimal spektral overlapp. Eksempelet vist i figur 1 med klonale populasjoner av pattedyr SupT1 celler illustrerer at strekkode celler med mCherry og cyano fluorescerende protein (CFP) kan enkelt analyseres samtidig uten å miste s…

Discussion

Her to veletablerte prosedyrer har blitt kombinert; genteknologi gjennom retroviral teknologi og påvisning av fluorescerende proteiner utnytte flowcytometri. Fluorescerende proteinbasert genetisk strekkoding for fremstilling av unike cellelinjer gir en robust og enkel måte for multipleksede anvendelser. Generering genetisk konstruerte celler strekkode gjennom retrovirale teknologi, er i utgangspunktet en langvarig prosess, men gjør det mulig å få tak i, når etablert, en pålitelig og stabil kilde til cellematerial…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10mL syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter	pall corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells