Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.
Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.
Teknologier som fluorescens spektroskopi, fluorescens mikroskopi og flowcytometri, alle er avhengige av fluorescens, en eiendom allment utnyttet i biokjemiske, biomedisinske, og kjemiske applikasjoner. Fluorescens, enten iboende eller ved merking, har vært utnyttet for analyse av protein uttrykk mønstre og profiler, celle skjebne, protein interaksjoner og biologiske funksjoner 1-9, og gjennom fluorescens / Förster resonans energioverføring for påvisning av biomolekyl interaksjoner og konformasjonsendringer 10-13. Etter isolering av Aequorea Victoria grønt fluorescerende protein (GFP) 14, oppdagelsen av flere naturlig forekommende fluorescerende proteiner fra andre nesledyrene, særlig koraller, har i stor grad økt antall eksisterende fluorescerende proteiner med skjelnes eksitasjon / emisjonsspektra. Disse, sammen med innføring av mutasjoner i genene 15-19, have ytterligere utvidet mulighetene, skaffe en ekte palett av fluorescerende proteiner tilgjengelig for forskere som utnytter mikroskopi, flowcytometri og andre fluorescens-basert teknologi for sin forskning.
I parallell, men uavhengig av hverandre, utviklingen av retrovirale teknologi har muliggjort drastisk stabil ekspresjon av ektopisk genetisk informasjon i pattedyrceller 20-23. Det er derfor ikke overraskende at denne teknologi har blitt brukt for å overføre gener av fluorescerende proteiner inn i en bred rekke celletyper og vev 24-28 eller for produksjon av transgene dyr 29-31. Etter arten av retrovirus, er det genetiske informasjon av ektopisk fluorescerende protein innført i genomet av cellen 32, og cellen blir fluorescerende `for ever'. Denne egenskapen har gjort sporing av celle skjebne, eller av en enkelt celle i en populasjon av celler. Den nå fluorescerende celle har dermed acquirød sin egen BioSignature og kan defineres som strekkode. Sin unike BioSignature identifiserer den fra andre celler, og viktigere, skiller den fra celler genetisk manipulerte til å uttrykke ulike fluorescerende proteiner med identifiserbar absorpsjon / emisjonsspekter. Biologiske applikasjoner som sporing av reprogrammerings faktorer mot pluripotency 33, analyse av faktorene subnuclear for klarlegging av nukleolært lokaliserings 34, konstruksjonen av fluorescerende reporter plasmider for transkripsjonelle studier 35 eller den genetiske merking av nerveceller for studiet av neuronal nettverksarkitektur 36 , er bare fire eksempler på de mange som har utnyttet ulike fluorescerende protein gener for samme eksperimentelle oppsettet.
Strømningscytometri er blitt mye brukt for analyse av biologiske prosesser på enkeltcelle-nivå, for eksempel genekspresjon, cellesyklus, apoptose, og signalisering gjennom fosforylasjon 37-43 sikret stabil uttrykk for fluorescerende protein gener i pattedyrceller har ytterligere forbedret nytten av flowcytometri for celle analyse 38,44 og ligand-reseptor interaksjoner 45. Forbedrede evner har lov flowcytometri for å bli en mye brukt metode for høy gjennomstrømming og høy-innhold screening 46. Til tross for den nå utvidet antall fluorometers og robotikk teknologier som kan par platelesersystemer, bildebehandling og flowcytometri, synes det å være en mangel i eksperimentell design som kan utnytte og tilpasse disse forbedrede teknologiske evner.
Raske, pålitelige, enkle og robuste celle-baserte metoder er drastisk behov for multiplekserte programmer som ytterligere forbedrer høy gjennomstrømming kapasitet. Dette er spesielt tilfelle når det gjelder medisiner hvor konstruksjonscellebaserte assays i en multiplekset format kan øke kraften i high-throughput screening 39,47-50 </sup>. Multipleksing, som gjør det mulig samtidige analyser i én prøve, forbedrer ytterligere high-throughput evner 51-54. Fluorescerende genetisk strekkoding gir ikke bare en elegant multipleksing, men også, når konstruert, omgår behovet for tidkrevende protokoller, reduserer kostnader ledsaget med antistoffer, perler og flekker 39,52,55, og kan redusere antall skjermer som kreves for høy- gjennomstrømning. Vi har nylig beskrevet hvordan retroviral teknologi kan forbedre multiplexing gjennom fluorescerende genetisk barcoding for biologiske applikasjoner, ved å uttrykke en analyse tidligere utviklet for å overvåke HIV-1 protease aktivitet 56,57 med forskjellige klinisk utbredte variantene 58. Metodikken er forklart i en mer beskrivende måte å fokusere på hvordan du velger og forsterke genetisk fluorescerende strekkode celler og hvordan å produsere paneler av klonale populasjoner som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner og / eller annen fluorescens intensitetenkaper. Paneler av cellepopulasjoner kan skjelnes fra hverandre på grunnlag av deres fluorescerende egenskaper forbedre multipleksede kapasiteter, som kan videre utnyttes i kombinasjon med cellebaserte assays som håndterer forskjellige biologiske spørsmål. Protokollen beskriver også hvordan man skal konstruere et panel av strekkode- celler som bærer en av de cellebaserte assays som tidligere er utviklet i laboratoriet, som i eksempel 59. Denne protokollen er således ikke ment å vise den veletablerte retroviral / lentiviral teknologi for genetisk overføring, verdien av fluorescerende proteiner eller anvendelser av flowcytometri 60,48, men i stedet for å vise den styrke kraft for å kombinere de tre for multipleksede anvendelser.
Her to veletablerte prosedyrer har blitt kombinert; genteknologi gjennom retroviral teknologi og påvisning av fluorescerende proteiner utnytte flowcytometri. Fluorescerende proteinbasert genetisk strekkoding for fremstilling av unike cellelinjer gir en robust og enkel måte for multipleksede anvendelser. Generering genetisk konstruerte celler strekkode gjennom retrovirale teknologi, er i utgangspunktet en langvarig prosess, men gjør det mulig å få tak i, når etablert, en pålitelig og stabil kilde til cellematerial…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Dr. Garry Nolan fra Stanford University for å gi Phoenix GP emballasje cellelinje for produksjon av retroviruspartikler. Vi takker Dr. Roger Tsien ved University of California i San Diego for å gi td Tomato. Vi vil også gjerne takke San Diego State University flowcytometrisystemer Kjerne Facility for sin service og hjelp.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
10mL syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
0.45µm plytetrafluoroethylen filter | pall corporation | 4219 | used for filtering the virus |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2mg/mL concentration used |
Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5µg/mL concentration. |
FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |