JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Published: April 14, 2015
doi:
10.3791/52452
, , , , , , ,
1Department of Biology,San Diego State University

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Böyle floresan spektroskopisi, floresan mikroskopi ve akım sitometri gibi teknolojiler, tüm floresan güveniyor, bir özellik yaygın, biyokimyasal biyomedikal ve kimya uygulamalarında kullandı. Floresan, içsel veya etiketleme yoluyla protein ekspresyonu ve profilleri, hücre kaderi, protein etkileşimleri ve biyolojik fonksiyonların 1-9 analizi için istismar ve olup olmadığını biyomolekülün etkileşimleri ve yapısal değişikliklerin tespiti için floresan / Förster rezonans enerji transferi yoluyla 10-13. Aequorea victoria yeşil flüoresan protein (GFP) 14 izolasyonu yana, diğer cnidarians, özellikle mercanlar ek doğal olarak oluşan floresan proteinlerin keşif, büyük ölçüde ayırt uyarma / emisyon spektrumları ile mevcut floresan proteinleri sayısı arttı. Bunlar, birlikte genlerinde 15-19 mutasyonların tanıtımıyla, have daha da araştırmaları için sitometri ve diğer floresan-tabanlı teknolojileri akış, mikroskopi istismar bilim adamları mevcut floresan proteinlerin gerçek bir palet elde, olanakları genişletti.

Buna paralel olarak, bağımsız olsa da, retroviral teknolojinin gelişmesi büyük ölçüde memeli hücrelerinde 20-23 ektopik genetik bilginin istikrarlı ifadesini kolaylaştırmıştır. Bu teknolojinin, hücre tipi ve dokusunda 24-28 geniş bir dizi halinde ya da transgenik hayvanların 29-31 üretimi için floresan protein gen transferi için kullanılmış olması şaşırtıcı değildir. Retrovirüslerin doğası sonra, dış floresan protein genetik bilgi hücrenin 32 genomu içinde ilave edilir ve hücre ever' `için floresan olur. Bu özellik, hücre kader izleme izin veya hücrelerin bir nüfus içinde tek bir hücrenin etti. Şimdi floresan hücre böylece acqui vardırkendi biosignature kırmızı ve barkodlanmaktadır olarak tanımlanabilir. Eşsiz biosignature diğer hücrelerden tanımlar, ve daha da önemlisi, genetik olarak ayırt emme / yayma spektrumlarının farklı floresan proteinleri ifade etmek için manipüle edilmiş hücrelerden ayıran. Bu tür pluripotensin 33 doğru yeniden programlama faktörleri izleme gibi biyolojik uygulamaları çekirdekçik lokalizasyonu 34 açıklanması için çekirdek içi faktörlerin analizi, transkripsiyonel çalışmaları 35 veya nöronal ağ mimarisi 36 çalışma için nöronların genetik etiketlemesi için flüoresan raportör plasmidlerin yapımı Aynı deney düzeneği için farklı floresan protein genleri istismar var birçok sadece dört örnekleridir.

Sitometrisi geniş olarak gen ekspresyonu, hücre döngüsü, apoptoz gibi tek hücre düzeyinde biyolojik süreçlerin analizi için kullanılmıştır ve fosforil yoluyla sinyal edilmiş debiMemeli hücrelerinde floresan protein genlerinin tirme 37-43 .The stabil ekspresyon ayrıca hücre analizi 38,44 ve ligand-reseptör etkileşimleri 45 için akış sitometrisi kullanımını artırmıştır. Gelişmiş yetenekleri sitometri yüksek verimli ve yüksek içeriği 46 taranması için yaygın kullanılan metodoloji haline akışını sağladı. Çift plaka okuyucu sistemleri, görüntüleme ve sitometri akabilir Fluorometreler ve robotik teknolojileri artık genişletilmiş sayısına rağmen, istismar ve bu gelişmiş teknolojik yetenekleri sığabilecek deney tasarımında bir eksiklik var gibi görünüyor.

Hızlı, güvenilir, basit ve sağlam hücre bazlı yöntemler büyük ölçüde daha yüksek verimli kapasitesini artırmak çoğaltılmış çok katlı uygulamalarda ihtiyaç vardır. Çoklanmış biçimde mühendislik hücre bazlı deneyler, yüksek verimli tarama 39,47-50 gücünü artırabilir burada ilaç keşfi alanında özellikle doğrudur </sup>. O bir örnekte eş zamanlı analizler veriyor gibi Çoklama, daha yüksek verimli yetenekleri 51-54 artırır. Floresan genetik barkodlama zarif çoğullamanın sağlar, fakat aynı zamanda, bir kere mühendislik, zaman alıcı protokollerin gereğini circumvents, antikorlar, boncuk ve lekeleri 39,52,55 eşliğinde maliyetlerini azaltır, ve yüksek için gerekli ekranların sayısını azaltabilir sadece hacimli uygulamalar. Son zamanlarda biyolojik uygulamalarda, daha önce farklı klinik yaygın varyantları 58 ile HIV-1 proteaz aktivitesi 56,57 izlemek için geliştirilen bir analiz ile ifade floresan genetik barkod ile çoğullama geliştirmek nasıl retroviral teknoloji tarif etmişlerdir. metodoloji seçmek ve genetik floresan barkodlu hücreleri yükseltmek ve farklı floresan proteinleri ve / veya farklı floresan intensit ifade klonal popülasyonlarının panelleri üretmek için nasıl nasıl odaklanan bir daha açıklayıcı bir şekilde izah edilirler. Fluoresan özelliklerine göre ayırt hücre popülasyonlarının paneller ayrıca farklı biyolojik soruları ele hücre bazlı tahlillerde ile kombinasyon halinde yararlanılabilir multiplekslenmiş yetenekleri geliştirmek. protokolü de, örneğin 59 gibi, daha önce laboratuar içinde geliştirilen hücre bazlı tahlillerde birini taşıyan Barkodlanan hücrelerin bir panelini mühendislik açıklamaktadır. Bu protokol, böylece genetik transferi için köklü retroviral / lentiviral teknoloji, floresan proteinlerin değeri veya 60,48 flow sitometri uygulamaları göstermek için tasarlanmamıştır değil çoğaltılmış uygulamalar için üç birleştirerek artırıcı gücünü göstermek için.

Protocol

Memeli Hücre, Genetik barkodlama için Viral Üretim ve İletim 1. Hazırlık Bir 10 sm'lik plaka içinde Plaka, 2.5 x 10 6 yapışan hücreler (veya yaklaşık% 50-60 konflüans) Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında% 10 fetal dana serumu (FCS) (FCS) içinde, transfeksiyondan önce bir gün. Böyle Phoenix-GP (Gary Nolan, Stanford Üniversitesi bir tür hediye) olarak tercih retroviral üretim kullanımlık ambalajlar hücre hattı için. Not: Ambalajlama hücre soyu, <em…

Representative Results

Çoğullama floresan genetik bireysel klonal popülasyonları üretilmiş olan sadece bir kere elde edilebilir biyolojik uygulamalarda amacıyla hücreler barkodlanmaktadır. Barkodlu popülasyonlar az spektral örtüşme net farklı floresan özelliklere sahip olduğunda Çoğullama en etkilidir. Memeli SupT1 hücrelerinin klonal popülasyonları, Şekil 1 'de gösterilen örnek mCherry ve siyano floresan proteini (CFP) ile Barkodlanan hücreleri kolayca bireysel floresan özelliklerini kaybetmeden…

Discussion

İşte iki köklü prosedürler kombine edilmiş; retroviral teknoloji ve flow sitometri kullanılarak floresan proteinlerin tespiti yoluyla genetik mühendisliği. Benzersiz hücre çizgilerinin üretimi için floresan protein bazlı bir genetik barkod çok katlı uygulamalar için sağlam ve basit bir yol sağlar. Retroviral teknoloji ile genetiği barkodlu hücreleri üreten, başlangıçta uzun bir süreçtir, ama bir kez, hücre malzeme güvenilir ve istikrarlı bir kaynak kurulan elde etmesini sağlar. Bu teknoloj…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz retroviral partiküllerin üretimi için Phoenix GP ambalaj hücre hattı sağlamak için Stanford Üniversitesi'nden Dr. Garry Nolan teşekkür etmek istiyorum. Biz td Domates sağlamak için Kaliforniya San Diego Üniversitesi'nden Dr. Roger Tsien teşekkür ederim. Biz de onların hizmet ve yardım için San Diego Devlet Üniversitesi Sitometrisi Çekirdek Tesisi teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
10mL syringes BD   309604 used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter pall corporation 4219 used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Corning 45000-304 cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine) poly sciences 23966-2  2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated) Eppendorf  5805 000.017 used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline) Corning 21-040-CV used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide) Sigma-Aldrich 107689 Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration. 
FACSAria BD Biosciences instrument used for sorting cell populations
FACSCanto BD Biosciences instrument used for cell analysis
Phoenix-GP Gift from Gary Nolan cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum Mediatech MT35015CV  used for cell growth and sorting
 SupT1 cells ATCC CRL-1942 Human T lymphoblasts
HEK 293T cells ATCC CRL-11268 Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640 Corning 10-040-CV cell growth media for SupT1 cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Bioquímica. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Bioquímica. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway – Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

Tags

Genetic BarcodingFluorescent ProteinsMultiplexed ApplicationsMolecular Cell BiologyRetroviral TechnologyCell TrackingCell PopulationsBiosignatureCell-based AssaysMultiplexing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Smurthwaite, C. A., Williams, W., Fetsko, A., Abbadessa, D., Stolp, Z. D., Reed, C. W., Dharmawan, A., Wolkowicz, R. Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications. J. Vis. Exp. (98), e52452, doi:10.3791/52452 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image