A Volume Bioassay pequeno para avaliar Bacteriana / fitoplâncton Co-cultura utilizando água-Pulse-Amplitude Modulada (água-PAM) Fluorometria
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
Os métodos convencionais para manipulação experimental de microalgas têm empregado grandes volumes de cultura (20 ml a 5 L), de modo que a cultura pode ser sub-amostrado ao longo da experiência 1-7. A subamostragem de grandes volumes pode ser problemática por várias razões: 1) que provoca variação no volume total e a área superficial: proporção em volume da cultura durante a experiência; 2) pseudo-replicação (isto é, a partir de duplicados de amostras ao mesmo balão de tratamento 8) é muitas vezes utilizados em vez de repetições verdadeiras (isto é, a amostragem de tratamentos replicados); 3) A duração da experiência é limitado pelo volume total; e 4) culturas axênicas ou a microbiota bacteriana normal são difíceis de manter, durante experimentos de longa duração como a contaminação geralmente ocorre durante subamostragem.
A utilização de placas de microtitulação permite volumes de 1 ml de cultura a serem utilizados para cada replicado, com até 48 tratamentos separados dentrouma placa de 12,65 cm x 8,5 x 2,2, diminuindo desse modo o volume e permitindo experimental para replicação extensiva subamostragem sem qualquer tratamento. Além disso, esta técnica pode ser modificado para caber uma variedade de formatos, incluindo: experimentais bacteriana-co-culturas de algas, algas, exames de fisiologia e toxina de rastreio 9-11. Pode ser amostrado poços individuais com uma alga, bactéria e / ou co-culturas para numerosos procedimentos laboratoriais, incluindo, mas não limitados a: ÁGUA-Pulse-amplitude modulada (WATER-PAM) fluorometria, microscopia, colónia bacteriana forming unit (ufc) condes e citometria de fluxo. A combinação do formato de placa de microtitulação e água-PAM fluorometria permite múltiplas medições rápidas de rendimento fotoquímico e outros parâmetros fotoquímicos com baixa variabilidade entre as amostras, de alta reprodutibilidade e evita as muitas armadilhas de subamostragem um garrafão ou erlenmeyer sobre o curso de um experimento .
Introduction
Fisiologia fitoplâncton tem sido tradicionalmente estudadas em experimentos meso-escala que varia de 20 ml em frascos cónicos de 5 L em garrafões 1-7. Esta escala experimental requer subsampling para o monitoramento experimental, como sacrificar amostras idênticas, para cada ponto de tempo cria uma montagem experimental incontrolável.
A capacidade para aumentar o número de experiências independentes utilizando o mesmo espaço incubadora diurna ao miniaturizar o volume experimental para experiências fisiológicas algas vai reduzir ou eliminar as limitações de sub-amostragem e pseudo-replicação a partir de grandes volumes. Um formato de placa de microtitulação foi desenvolvido para bioensaios de algas, utilizando um volume de 1 ml de cultura para manipulação experimental algas em condições variáveis. Este pequeno volume experimental permite o número de repetições de ser aumentada, aumenta a reprodutibilidade experimental devido a uma menor variabilidade entre as amostras replicadas eexperiências, e permite a replicação verdadeira, mantendo controles experimentais (ou seja, culturas de algas axênicos) para 140 dias (Figura 2) 12.
Este formato de placa de microtitulação é facilmente adaptado para uma variedade de questões experimentais, tais como: não uma bactéria ter uma interacção simbiótica, neutro ou patogénica com o seu hospedeiro de algas? É a adição de um composto estimulante ou tóxico para uma alga? Estas e outras questões podem ser abordadas de uma forma de alto rendimento rápido, utilizando este novo formato 9-11.
Uma placa de 48 poços de cultura de microtitulação permite a cada poço 1 ml de ser uma montagem experimental independente que é amostrada num único ponto de tempo. Vários parâmetros podem ser amostrados a partir desse volume de 1 ml, incluindo, mas não limitados a: a fluorescência e os parâmetros fotoquímicos utilizando-amplitude modulada ÁGUA-Pulse (WATER-PAM) fluorometria (ver Materiais e Equipamento tabela) 13. ÁGUA-PAM fluorometria é uma técnica rápida e não-invasiva, que pode ser utilizado para monitorizar as experiências realizadas com 13 algas. Ele permite a medição da eficiência fotossintética e saúde PSII de um pequeno volume de cultura (150-300 mL de cultura diluída em meio a um 2 – Volume 4 ml de água-PAM) 14,15. Além ÁGUA-PAM fluorometria, esta configuração pode ser usada para medir uma variedade de outros parâmetros, incluindo, mas não limitados a: a microscopia para visualizar as bactérias associadas às células de algas e as alterações na morfologia de células de algas; colônia de bactérias (UFC) contagens de unidade; e citometria de fluxo para a contagem de células de algas e as subpopulações de identificação.
Protocol
Representative Results
Discussion
O crescimento de algas em um formato miniaturizado.
A miniaturização de culturas de algas a um volume de 1 ml de cultura numa placa de microtitulação permite a replicação dentro de uma experiência para ser aumentado. É importante garantir a alga é saudável durante todo um experimento; executar uma curva de crescimento (Figura 2), utilizando o formato de placa de microtitulação para avaliar vários meios de algas, para garantir o cumprimento dos requisitos nutriciona…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
Referências
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