원자 힘 분광학에 의해 단일 분자 접착 조사
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
원자 힘 분광법은 표면 및 계면의 분자를 연구하는 이상적인 도구입니다. 공유 AFM 팁 위에 몇 단일 분자의 큰 다양한 실험 프로토콜을 제시한다. 동시에 AFM 팁은 AFM 팁에 부착 된 단일 분자를 연구하기위한 필수 조건이다 팁과 기판 사이의 비특이적 인 상호 작용을 방지하기 위해 비활성화된다. 분석은 부착력, 접착 길이, 곧 발표되고 상기 판독을위한 외부 참조가 제공되는 고체 표면과 바이오 인터페이스에 대한 이들 분자의 자유 에너지를 결정한다. 예 분자는 폴리 (아미노산) polytyrosine이며, 그래프트 중합체 PI- g -PS 및 인지질 POPE (1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine). 이 분자는 CH 3 -SAMs 같은 다른 표면, 수소 종료 다이아몬드로부터 탈착 다양한 용매 조건에서 지질 이중층을 지원합니다. 마지막으로,힘 분광 단일 분자 실험의 장점은 진정한 단일 분자 실험에서 연구 된 경우 수단이 결정을 포함하여 논의된다.
Introduction
지난 30 년간, 원자력 현미경 (AFM)은 그것이 모든 입체적 분자 공간 해상도를 제공하고, 다양한 용매에서 동작 할 수 있기 때문에 생체 1,2- 합성 3 재료 및 표면을 연구하는 귀중한 영상 법 것으로 밝혀졌다 환경. 또한, AFM-단일 분자 힘 분광법 (SMFS)이 정권을 μN하기 위해 PN에 이르기까지 힘을 측정 할 수있게하고 4,5 단백질 층으로 예를 들어 전례없는 통찰력, 고분자 물리학 6 주신 – 8 및 단일 분자 표면의 상호 작용 (9) – 단일 분자보다는 분자의 앙상블을 공부 뒤에 12 국지적 인의 이론적 근거는 종종 드문 사건이나 숨겨진 분자 상태를 마스크 효과를 평균 방지하는 것입니다. 또한, 등 윤곽 길이, 쿤 길이, 접착 자유 에너지, 분자 매개 변수의 다수가 될 수 있습니다를 얻을. 이것은 아래의 예에서 자세히 설명되어 있습니다. 전형적인 AFM-SMFS 실험에서, 프로브 분자는 링커 분자를 통해 매우 날카로운 팁에 연결된다. 팁 자체가 굴곡 외팔보의 단부에 위치한다. 팁이 표면에 접촉되는 경우, 프로브 분자가이 표면과 상호 작용한다. 표면으로부터 분자를 분리하기 위해, 팁, 힘, 따라서 자유 에너지의 후퇴시에 캔틸레버의 편향을 관찰함으로써 결정될 수있다. 의미있는 통계를 가져, 소위 힘 – 거리 곡선 다수 획득되어야한다. 또한, 프로브 분자가 AFM 팁에 공유 적으로 결합되어야한다 (즉, 하나의 전체 실험 기간에 걸쳐 동일한 프로브를 사용하는 분자) 진정한 단일 분자 실험을 갖도록. 여기서, 공유 결합을 통해 단일 분자로 기능화 캔틸레버 용 실험 프로토콜이 제시된다. 단일 분자가 하나 또는 아미노 티오 통해 연결될 수있다AFM 팁에 L 그룹. 접합 공정은 사용되는 중합체의 용 매화 특성에 대해 설명 할 (유기 및 수성) 용매의 광범위한 다양성으로 수행 될 수있다.
첫 번째 부분에서는 일반적인 프로토콜은 공유 설명 AFM 팁에 링커 분자를 통해 단일 분자 ( "프로브 분자")을 첨부합니다. 이를 위해, NHS- 유기 화학 또는 말레이 미드 13 사용된다. 세 개의 예시적인 분자 프로토콜과 함께, 데이터 수집 및 데이터 분석 프로세스를 설명하고 상기 판독 참조가 제공된다. 예 분자는 다음과 같습니다 (선형) 폴리머 티로신, 그라프 트 중합체 PI- g -PS 및 지질 교황. 예 공유 시스테인을 연결하는이 프로토콜의 약간의 변형을 포함한다. 또한, 섹션은 이러한 다이아몬드 표면, CH 3 – 자체 조립 단층 및 지질 이중층으로 다른 표면의 준비에 최선을 다하고 있습니다. 이러한 인터페이스는 잠을욕실은 좋은 참조 및 예제가 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 수십 년 동안, 단일 분자 실험은 분자 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공하는 생명 과학 이후에 매우 중요한 접근 방법 드러났다. SMFS 실험 이상적으로 하나의 동일한 분자 실험의 전체 과정에 걸쳐 사용하고 의미에서 좋은 통계를 달성했다. 앙상블 분자의 실험과 대조적으로, 실험 SMFS 희귀 이벤트 및 숨겨진 분자 상태를 감지 할 수있다. 단일 분자 실험의 또 다른 장점은 분자 동력학 시뮬레?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
Referências
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