原子間力分光法による単一分子の接着性を調査
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
原子間力分光法は、表面や界面での分子を研究する理想的なツールです。共有結合的にAFMチップ上に結合する単一分子の多種多様の実験プロトコルが提示される。同時に、AFMチップはAFMチップに結合した単一の分子を研究するための前提条件でチップと基板との間の非特異的相互作用を防止するために不動態化される。固体表面にバイオインターフェイス上の接着力、密着長さ、およびこれらの分子の自由エネルギーを決定するための分析がすぐに提示され、さらに読み出し用の外部参照が提供される。例分子は、ポリ（アミノ酸）、ポリチロシン、グラフトポリマーPI- グラム -PSおよびリンPOPE（1-パルミトイル-2- oleoyl- のsn -glycero -3-ホスホエタノールアミン）である。これらの分子は、CH 3 -SAMsのような異なる表面、水素終端ダイヤモンドから脱着や各種溶剤条件下における脂質二重層をサポートされています。最後に、力分光法の利点は、単一分子実験は真に単一分子実験で研究されているかどうかを決定するための手段を含む、議論されている。
Introduction
過去30年間に、原子間力顕微鏡（AFM）は、すべての3つの次元での分子の空間分解能を提供し、様々な溶媒中で動作させることができるので、生物学1,2および合成3の材料および表面を研究するための貴重なイメージング技術であることが判明している環境。加えて、AFM-単一分子力分光法（SMFS）はpNからμN政権に至るまで力を測定することが可能になり、4,5の折り畳みタンパク質に例えば前例のない洞察を与えている、高分子物理学6から8、および単一分子-表面相互作用9 –単一分子ではなく、分子のアンサンブルを研究の背後にある12 .theの根拠は、多くの場合、稀な事象や隠された分子状態をマスクする効果を平均化することを避けることである。さらに、このような等輪郭長、クーン長、接着自由エネルギー、などの分子パラメータの多数であることができる得。これは、以下の実施例に詳述されている。典型的なAFM-SMFS実験では、プローブ分子は、リンカー分子を介して非常に鋭い先端部に連結されている。チップ自体は曲げられる片持ち梁の端部に配置されている。先端が表面と接触した場合、プローブ分子は、この表面と相互作用する。表面から分子を分離するために、先端部の後退時にカンチレバーのたわみ、力、ひいては自由エネルギーを観察することによって決定することができる。意味のある統計値を得るために、いわゆる力 – 距離曲線の多数を取得しなければならない。さらに、真の単一分子実験（ すなわち 、1つを使用して、全実験期間にわたって同じプローブ分子）を有するプローブ分子は、AFMチップに共有結合されるべきである。ここで、共有結合を介して単一分子カンチレバーの官能化のための実験プロトコルが提示される。単一分子は、アミノまたはチオ介して結合することができるいずれかAFMチップのL群。コンジュゲーションプロセスは、使用されるポリマーの溶媒和特性を考慮して、溶剤（有機及び水性）広範な種類の中で行うことができる。
最初の部分では、共有結合的にAFMチップを、リンカー分子を介して単一分子（「プローブ分子」）を取り付けるための一般的なプロトコールが記載されている。この目的のために、有機NHS-またはマレイミド化学を13に使用される。 3つの例示的分子のためのプロトコルと共に、データ収集及びデータ解析プロセスが記載され、さらに読み出し用の参照が提供される。例分子である：（リニア）ポリマーチロシン、グラフトポリマーPI-G -PSおよび脂質POPE。これは共有結合システインを添付する例えば、プロトコルのわずかな変動が含まれています。また、セクションは、そのようなダイヤモンド表面、CH 3 -self組織化単分子膜と脂質二重層として異なる面の準備に専念しています。これらのインタフェースは、箴を持っているEN良い参照と例であることを。
Protocol
Representative Results
Discussion
最後の数十年の間に、単一分子実験は分子メカニズムに前例のない洞察を提供し、生命科学とそれ以降で非常に貴重なアプローチであることが判明しました。 SMFS実験の良い有意義な統計値を達成するために、理想的には、同一の分子は、実験の全体にわたって使用されている。分子のアンサンブルを用いた実験とは対照的に、SMFS実験は稀な事象と隠された分子状態を検出すること?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
Referências
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