Анализ изменений экспрессии генов в гиппокампе крыс после глубокого мозга стимуляции передней ядра таламуса

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

Глубокая стимуляция мозга (DBS) хирургии, целенаправленного воздействия на различные области мозга, такие как базальных ганглиев, таламуса и гипоталамических регионах, является эффективным средством для лечения ряда заболеваний опорно-двигательного которые не отвечают на лекарства. Недавний прогресс в области DBS хирургии начал распространить применение этого хирургического метода в других условий как разнообразны, как и патологическое ожирение, депрессии и обсессивно-компульсивного расстройства. Несмотря на эти расширения показаний, мало известно о лежащих в основе физиологических механизмов, которые способствуют благоприятные эффекты DBS хирургии. Один подход к этому вопросу, чтобы провести анализ экспрессии генов в нейронах, которые получают электрическую стимуляцию. Предыдущие исследования показали, что нейрогенез в зубчатой ​​извилине крысы это вызвало в DBS ориентации переднего ядра таламуса ^1. DBS хирургии ориентации АТН широко используется для лечения рефрактерной эпилепсии. Таким образом, гораздо Interesт для нас, чтобы исследовать транскрипционные изменения, вызванные электрической стимуляцией АТН. В этой рукописи мы опишем наши методологии стереотаксически наведением DBS хирургии, нацеленной на ATN у взрослых самцов крыс линии Вистар. Мы также обсудим последующие шаги для рассечения тканей, выделения РНК, синтеза кДНК и количественного RT-PCR для измерения изменений экспрессии генов. Этот метод может быть применен и модифицированы для стимулирования базальных ганглиев и других областей мозга, обычно клинически целевой. Исследование экспрессии генов описаны здесь предполагает подход гена-мишени кандидата для знакомства с молекулярные игроков, которые могли бы быть направляющие механизма DBS.

Introduction

История за развитие Глубокая стимуляция мозга в нейрохирургической техники восходит к 1870, когда возможность электрической стимуляции схемы мозга была изучена ^2. Использование хронической стимуляции высокой частоты как средства для лечения нервных расстройств началось в 1960-х годах ^3. Затем в 1990-х годах с появлением хронической имплантации DBS электродов ^4-6, количество нейронных нарушений, которые были обработаны с помощью DBS продолжает увеличиваться. Глубокая стимуляция мозга был впервые использован в США для лечения тремора ^6. Сегодня хирургия широко используется для лечения нервных расстройств, которые в настоящее время не поддается лечению с помощью фармакологического вмешательства. DBS в настоящее время используется для лечения двигательных расстройств, болезни Паркинсона и дистонии ^7-9. Типа деменции Альцгеймера, болезнь, эпилепсии, боли и психоневрологических заболеваний, таких депрессия Гентингтона, ОКР, синдром Туретта7, S синдром и наркомании некоторые из состояний, поддающихся лечению DBS ^10-12. В то время как DBS хирургия FDA одобрен для лечения болезни Паркинсона, дистонии и эссенциальный тремор, использование DBS для лечения других условий, упомянутых выше, в различных стадиях лаборатории и клинических исследований, которые предлагают большое обещание для пациентов ^13,14.

Клинически DBS операция проводится в два этапа. Первый этап включает в себя хирургическим позиционирования электродов DBS в целевой анатомической локализации с использованием комбинации радиационной позиционирования, КТ, МРТ, а также показания микроэлектродные для повышения точности. Второй этап включает в себя имплантацию генератор импульсов в верхней части грудной клетки пациента и установки удлинителей из головы к генератору импульсов. На основании неврологического состояния, несколько схем программирования для генератора импульсов были стандартизированы, и будет использоваться для доставки требуемого напряжения. Окончательный обТаге достигается ступенчато так, чтобы получить лучший клинический ответ при минимальном напряжении ^15. Тем не менее, в наших исследованиях, в отличие от хронических имплантатов DBS используется в клинике, для простоты, мы прибегли к изучению одноразовый высокой частоты стимуляции (в течение 1 часа) в наших моделях животных.

Часть исследований нашей группы сосредоточена на исследовании использование DBS хирургии для лечения резистентной эпилепсии. Стереотаксические хирургические подходы с использованием высокочастотного стимуляции был исследован многими другими в качестве эффективного варианта для лечения медицинским огнеупорной эпилепсии, которая составляет около 30% всех инцидентов эпилепсии ^10,16,17. Мозжечка стимуляция ориентации поверхности коры, а также глубоких мозжечка ядер были использованы в прошлом в качестве мишеней для лечения эпилепсии ^10,18,19. Кроме того, гиппокамп стимуляции также пытались, но с переменным успехом ^20,21. Некоторые из других исследованныхDBS цели при эпилепсии, включают в кору головного мозга, таламус, гипоталамический ядро и блуждающий нерв ^8. Тем не менее, следующие результаты нескольких исследований, в последние несколько лет, передняя ядра таламуса (АТН) стала наиболее распространенной цели DBS для лечения эпилепсии ^10,22. Опираясь на знания о нейроанатомической схемы и выводы из животных моделях, некоторые исследования были сосредоточены на терапевтический эффект глубокой стимуляции мозга АТН в лечении эпилепсии ^23-26. АТН является частью лимбической цепи и находится в области мозга, которое поражает частоты приступов. Исследования Хамани и др., Проверили эффективность ATN-DBS в пилокарпина индуцированной эпилепсии модели и обнаружили, что двустороннее стимуляция ATN продлен задержки для пилокарпина, вызванных судорог и эпилептический статус ^24. Кроме того, высокая частота стимуляции ATN приводит к снижению частоты приступов в Пентилентетразол (PTZ) модели EPilepsy ^25,27-29. Ли и др., Сообщили среднее снижение частоты приступов на 75% при хронической глубокой стимуляции мозга в ATN в лечении огнеупорной парциальная эпилепсия ^30.

Недавние клинические исследования по лечению резистентной эпилепсии показали многообещающие результаты после DBS хирургии, направленных на передней ядра таламуса (ATN) ^22. Многоцентровое рандомизированное клиническое исследование с 110 пациентов, перенесших двустороннюю DBS в ATN для лечения огнеупорных эпилепсии (SANTE суда) показали снижение частоты приступов примерно на 40% ^31. Результаты этого исследования также намекнул на задержки оптимального Противоэпилептические эффекта, наблюдаемого в 2-3 месяцев после операции. Дальнейшие исследования по Toda и др., Подтвержденные с этими выводами, где они показали, нейрогенез происходит в более позднее время поста DBS (дни 3-5) в животных моделях ^1. Кроме того, Encinas и др., Сообщили гиппокампа neurogeneSIS в взрослых мышей зубчатой ​​извилине после высокочастотной стимуляции ATN ^32. Предыдущие исследования ^33-35 сообщали снижается гиппокампа нейрогенеза в некоторых эпилептических таких случаях, как хроническая височной эпилепсии лепестка и ассоциации с дефицитом обучения, ухудшение памяти и спонтанных периодических приступов двигателя. Кроме того, было снижение в нервных факторов стволовых клеток-предшественников, таких как FGF2 и IGF-1 в хронически эпилептического гиппокампа у животных моделей ^33. Учитывая это, интервенционные стратегии, такие как DBS, которые показывают увеличение нейрогенеза в зубчатой ​​извилине захватывающие возможности для исследований. Эти данные побудили нас исследовать дальше глубоко в механизм, лежащий лечения нейрогенез после DBS эпилепсии. Мы нацелены АТН как в одностороннем порядке (данные не сообщается), а также на двусторонней основе (в представительных результатов) и видел возведен нейротрофин (BDNF) выражение в крысу зубчатой ​​извилины. Наша сомер текущего гипотеза, что выражение BDNF инициирует выражение каскад генов, кульминацией нейрогенеза, что в переводе с анти-эпилептического эффекта DBS хирургии. В этой статье мы представляем наши методы для DBS хирургии, нацеленной на ATN у крыс с последующим анализом экспрессии генов в качестве привлекательного подхода к изучению механизма, лежащего преимущества DBS.

Protocol

О себе Этика:: Примечание Все процедуры, описанные в этой рукописи в соответствии с руководящими принципами NIH для исследования на животных (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных) и утверждаются Гарвардской медицинской школы IACUC комитетом. 1. Предопе?…

Representative Results

Фигуры 1А и 1В показывают относительную экспрессию BDNF и GABRD по отношению к генной управления β-актина. BDNF, нейротрофин часто ассоциируется с нейропротективных эффектов во многих нервных заболеваний, 38-41. Поэтому интересно проанализировать профиля экспрессии BDNF ?…

Discussion

После работы ориентир по Benabid и др. При помощи глубокой стимуляции мозга для лечения болезни Паркинсона и эссенциальный тремор, хирургическая техника DBS была исследована с большим интересом за последнее десятилетие для лечения многих неврологических расстройств ^6,10,43. Иссле?…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500