Este artigo descreve um método para criar uma lesão mecânica do vaso em embriões de peixe-zebra. Este modelo de lesão fornece uma plataforma para estudar hemostasia, inflamação relacionada a lesões e cicatrização de feridas em um organismo ideal para microscopia em tempo real.
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Artigo de método
Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embriões de peixe-zebra (Danio rerio) provaram ser um modelo poderoso para estudar uma variedade de processos de desenvolvimento e doenças. O desenvolvimento externo e a transparência óptica tornam esses embriões especialmente passíveis de microscopia, e numerosas linhagens transgênicas que rotulam tipos específicos de células com proteínas fluorescentes estão disponíveis, tornando o embrião de peixe-zebra um sistema ideal para visualizar a interação de vasculares, hematopoiéticas e outros tipos de células durante a lesão e reparo in vivo. A genética direta e reversa no peixe-zebra está bem desenvolvida e a manipulação farmacológica é possível. Descrevemos um modelo de lesão vascular mecânica usando técnicas de micromanipulação que explora várias dessas características para estudar as respostas à lesão vascular, incluindo hemostasia e reparo de vasos sanguíneos. Usando uma combinação de microscopia de vídeo e timelapse, demonstramos que esse método de lesão vascular resulta em respostas mensuráveis e reprodutíveis durante a hemostasia e o reparo da ferida. Este método fornece um sistema para estudar lesões vasculares e reparos em detalhes em um modelo animal inteiro.
Introdução
O peixe-zebra tem sido usado extensivamente para estudar uma variedade de tópicos em biologia vascular, incluindo desenvolvimento vascular, angiogênese e desenvolvimento e patologia hematopoiética1-3. Os embriões desenvolvem uma circulação funcional, bem como leucócitos e outros componentes do sistema imunológico inato até 1 dia após a fertilização (dpf) 1,4,5. A conservação da resposta inflamatória e leucocitária à lesão tornou o embrião de peixe-zebra um modelo informativo para processos inflamatórios tão diversos como infecção tuberculosa, enterocolite e regeneração tecidual6-9. Embriões de peixe-zebra têm sido usados para estudar a....
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Protocolo
NOTA: Os procedimentos que utilizam peixe-zebra foram aprovados pelo Institutional Animal Care da UCSF e Comitê de Uso.
1. Preparação de Ferramentas
- Insira pin minúcia em um suporte de pino e prenda o pino.
- Utilizando uma pinça de ponta fina, dobre com cuidado a ponta do pino para criar um ligeiro gancho.
- Para manipulação e estabilização do embrião durante a lesão, dobre a extremidade de um calibre 28 ½ polegadas agulha montada em uma seringa de insulina usando alicates.
2. Preparação de embriões Zebrafish por lesão
- Configure casais reprodutores de peixes-zebra e....
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Resultados
A lesão mecânica vaso foi realizada em 2 dpf embriões (Figura 2A - C). Resultados da lesão em um resposta rápida e confiável de coagulação medida pelo tempo de interrupção do sangramento (Figura 2D). Para determinar se ou não diferenças na resposta de coagulação pode ser medido, o anticoagulante hirudina foi administrada aos embriões por injecção para dentro da conduta de Cuvier imediatamente antes do ferimento (5-10 nl de 1 unidade por ul de hirudina dissolvidos em águ.......
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Discussão
Zebrafish têm sido utilizados com sucesso como um modelo para vários tipos de feridas, incluindo lesão de laser 13-15, trombose induzida por laser 16, e epitelial ferindo 10. Relata-se um método de ferimento mecânico que é simples de executar e produz uma lesão controlada num modelo in vivo, que é altamente favorável à microscopia em tempo real. Resultados da lesão em um resposta hemostática rápida e mensurável e um programa de reparação ferida reprodutível que pode ser.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Stephen Wilson e Lisa Wilsbacher pelas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH HL054737.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Diâmetro da ponta 0.0125 mm, diâmetro da haste 0.1 mm |
| Suporte de pino | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Slide de Depressão de Vidro | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Baixo Derretimento Agarose | Lonza | 50081 | Pré-aquecido a 42 º C |
| N-feniltioureia (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| ácido 3-aminobenzóico (tricaína) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Placas de imagem com fundo de vidro | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Microscópio de dissecação | Olympus | SZH10 | |
| Zeiss | Axio Observer | ||
| Sais de aquário Seringa | instantânea para o oceano | ||
| com agulha de 28,5 G | Becton Dickinson |
Referências
- Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
- Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
- Ellett, F., Lieschke, G. J.
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Reimpressões e permissões
