भ्रूण कृंतक दिमाग से प्राथमिक Mesencephalic डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव, संस्कृति और लंबी अवधि के रखरखाव
Summary
The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.
Abstract
Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.
Introduction
सब्सटेंशिया निग्रा से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की हानि कॉम्पेक्टा पार्किंसंस रोग (पीडी), दूसरा सबसे प्रचलित neurodegenerative विकार के कार्डिनल मोटर लक्षण की ओर जाता है pars। इस mesencephalic न्यूरोनल आबादी के निधन के पीछे कारण ज्ञात नहीं है। इस्तेमाल किया गया है विकास और neurophysiological गुण और mesDA न्यूरॉन्स, कई सेल संस्कृति और पशु मॉडल प्रणाली के अस्तित्व के नियमन के लिए जिम्मेदार जैव रासायनिक रास्ते का अध्ययन करने के लिए। चूहे डोपामिनर्जिक सेल लाइन 1RB 3 एक 27 (N27), मानव डोपामिनर्जिक neuroblastoma सेल लाइन एसएच SY5Y, MN9D और मानव mesencephalic कोशिकाओं LUHMES माउस डोपामिनर्जिक संकर सेल लाइन सहित अमर सेल लाइनों, जैव रासायनिक और सीमित यंत्रवत अध्ययनों एक के लिए इस्तेमाल किया गया है -5। MesDA न्यूरॉन्स के विशिष्ट नुकसान के अध्ययन के लिए, कई न्यूरोटॉक्सिन आधारित और आनुवंशिक मॉडल 6-8 विकसित किया गया है। प्राथमिक उदर मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की न्यूरोनल और synaptic गुण और इस आम बीमारी के रोगजनन में शामिल रास्ते के अध्ययन के लिए एक अनिवार्य उपकरण प्रदान करते हैं।
यहाँ हम उच्च survivability और भ्रूण प्रति coverslips की वृद्धि की उपज में जिसके परिणामस्वरूप संशोधनों में शामिल है जो mesencephalic डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव, के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। पूर्व परिपक्व E12.5 माउस mesencephalon (चूहे में E14.5) का प्रयोग जीवित रहने को बढ़ाता है। इस उम्र में न्यूरॉन्स विच्छेदन के दौरान बरकरार कोशिकाओं को छोड़ देता है, जो अभी तक एक्सोन विकसित की है और जिससे काफी व्यवहार्यता तनाव को बढ़ाने के कम से कम नहीं है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल की धारा 2 में वर्णित के रूप में उदर मध्यमस्तिष्क से सावधान विच्छेदन, आगे जीवित रहने को बढ़ाता है। भ्रूण प्रति coverslips की संख्या बढ़ाने के लिए, एक वैकल्पिक चढ़ाना विधि इस प्रोटोकॉल की धारा 4 में प्रस्तुत किया है। इस के तहत चार coverslips की तुलना में भ्रूण प्रति अप करने के लिए 10 coverslips की उपज के लिए ले जाता हैमानक चढ़ाना शर्तों इस प्रकार प्रयोग प्रति जानवरों की राशि को कम करने।
Axons और dentrites की संस्कृति प्रदर्शनी परिणाम में न्यूरॉन्स, synaptic कनेक्शन फार्म और लाइव सेल इमेजिंग, immunocytochemical और electrophysiological अध्ययन के लिए इन संस्कृतियों उपयुक्त बनाने न्यूरोनल और synaptic मार्कर की उपस्थिति का पता चलता है। इसके अलावा, neuronal संस्कृतियों का उपयोग आनुवंशिक और pharmacologic हेरफेर की सुविधा। इन विट्रो में 2 दिन से neurites की परिणाम विकासात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, संस्कृतियों के दीर्घकालिक अस्तित्व (अप करने के लिए छह सप्ताह) इन न्यूरॉन्स की धीमी गति, प्रगतिशील अध: पतन के अध्ययन के लिए उन्हें उपयुक्त बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मध्यमस्तिष्क में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में डोपामाइन का मुख्य स्रोत हैं। वे तीन समूहों में बांटा जाता है, सब्सटेंशिया निग्रा पार्स कॉम्पेक्टा (SNpc), उदर tegmental क्षेत्र (वीटीए) और re…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117) | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048) | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors – Straight 11.5cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
Referências
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