Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği
Summary
Bu yazıda çiçek mayası Saccharomyces cerevisiae içinde, sumoylation ve kinetochore proteinleri, Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna bağlanmasını anlatır.
Abstract
Fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon, ubikitinasyon ve sumoylation gibi post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS), pek çok protein, hücresel fonksiyonu düzenleyen. Sentromerik DNA ile ilişkilendirmek kinetochore proteinlerin PTMS genom istikrarı korumak için sadık kromozom tecrit aracılık eder. Bu tür kütle spektrometrisi ve western blot analizi gibi biyokimyasal yaklaşımlar en yaygın PTMS tanımlanması için kullanılır. Burada, bir protein saflaştırma yöntemi Saccharomyces cerevisiae'de kinetochore proteinler, Ndc10 ve Ndc80, bir sumoylation ubikuinasyon hem saptanmasına izin veren tarif edilmektedir. Ndc10 Myc-etiketli ya Ndc80 inşa ve çalışmaları için kullanılmıştır ifade polihistidin-Flag-işaretli Smt3 (HF-Smt3) ve A suşu. Sumoylation saptanması için, nikel boncuklar kullanılarak His ile etiketlenmiş sumoylated proteinleri saflaştırmak için bir protokol geliştirilmiştir ve sumoylated Ndc10 a tespit etmek için bir anti-myc antikor ile Western blot analizi kullanılannd Ndc80. Ubikitinasyon saptanması için, Myc-etiketli proteinlerin immüno için bir protokol geliştirilmiştir ve Ndc10 ve Ndc80 ubikitinlenmiş olduğunu göstermek için anti-Ub antikor ile Western blot analizi kullanılmıştır. Bizim sonuçlarımız His-Bayrak ilgi epitop etiketli protein Smt3 suşu birden PTMS tespitini kolaylaştırır etiketlenmiş olduğunu göstermektedir. Gelecekteki çalışmalar bu tekniğin sömürü belirli bir PTM bağımlı protein etkileşimleri belirlemek ve tanımlamak için izin vermelidir.
Introduction
Sırasıyla bir hedef proteine (S. cerevisiae 1 Smt3 SUMO) yayılmasını ve sumoylation ubikitin ve küçük Ubikuitin benzeri değiştirici konjügasyonunu sağlar. Kinetochore proteinlerinin PTMS sadık kromozom segregasyonu sağlamak için farklı bir hücre döngüsü aşamaları sırasında hücresel düzeyleri ve protein-protein etkileşimlerini etkiler. Örneğin, Cse4 / CENP-A ve dış kinetochore proteini Dsn1 hücresel düzeyleri genom stabilitesini 2-5 sağlanması için ubikuitin-aracılı proteolizi ile düzenlenir. Yanlış kinetochore-mikrotübül ekleri destabilizasyonu doğrudan mikrotübül 6-8 ile etkileşim Dam1 ve Ndc80 kompleksleri fosforile Ipl1 / Aurora B kinaz gerektirir. Yetmiş üzerinde kinetochore proteinlerin belirlenmesi rağmen, PTMS, örneğin ubikitin ve SUMO ile bu proteinlerin değişiklikler araştırmak çok az sayıda çalışma vardır. Büyük bir sınırlama PTM korumak için yeteneğisaflaştırma ve sumoylation, fosforilasyon, metilasyon, ve diğerleri gibi PTMS tespiti için özel antikorların yetersizliği s üzerine çıkar. Sumoylated kinetochore proteinlerin karakterizasyonu Ndc10, Cep3, Bir1 ve Ndc80 özel bir antikor 9 kullanılmaktadır. Buna ek olarak, Ndc10 ubikitinasyon 10, bir alt-tabaka olarak dahil edilmiştir. İnsan Hec1 (S. cerevisiae'deki Ndc80), APC / Cı-hCdh1 E3 ligaz 11 düzenlenir, ubikitinasyon için maddedir. Bu nedenle, Ndc10 ve Ndc80 S. sumoylation ve ubikitinasyona hem algılamak için protokol optimizasyonu için iyi adaylardır cerevisiae.
Sumoylation belirlenmesini kolaylaştırmak için, HF-Smt3 ve Myc etiketli Ndc10 veya Ndc80 ifade eden suşları inşa. epitop etiketleri (HF: His6-Bayrak) kullanılması nedeniyle sık, bir aday proteine karşı poliklonal serum içinde gözlenir çapraz reaktivite arka en aza indirir. Biz afinite bir protokol geliştirdiHF-Smt3 birleşikleri saflaştırılması ve daha sonra saf hale Smt3 hazırlanmasında sumolyated Ndc10 ve Ndc80 varlığını tespit etmek için, ticari bir anti-Flag ve anti-myc antikoru kullanılır. Ubikitinasyon sağlamak için, Myc-etiketli kinetochore proteinlerinin dağılmasını koruyan bir tadil edilmiş immüno protokolü tasarlanmış ve Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna tespit etmek için ticari bir anti-Ub antikoru ile Western Blot analizi gerçekleştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
HA, Myc, Bayrak ve GST edildiği gibi epitop işareti yaygın proteinlerin biyokimyasal analizi için kullanılmıştır. HF-Smt3 ve Ndc10 ve Ndc80 Myc-etiketli kinetochore proteinler ile suşların inşaatı, örneğin sumoylation ubikuinasyon olarak PTMS tespitini kolaylaştırır. HF-Smt3 tahlil aşağı çekme sumoylated kinetochore proteinler, Ndc10 ve Ndc80 (Şekil 1) algılanmasını sağlar. Anti-Flag antikor kullanılarak afınite saflaştırma protokolü ve western lekeleme analizi, HF-Smt3 ve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Materials
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
Referências
- Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
- Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
- Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
- Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genética. 194, 513-518 (2013).
- Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
- Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
- Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
- Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
- Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
- Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genética. 172, 783-794 (2006).
- Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
- Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
