Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
Det har gått över ett halvsekel sedan den första rapporten av naturligt förekommande DNA modifieringar i form av cytosin metylering 1. Cytosine metylering är en modifierad cytosin nukleotid bas där den 5: e kolet på basen ringen har en metylgrupp (5-MC), vanligast förekommande i CpG dinukleotiden motiv i däggdjursgenom. Den funktionella närvaro av 5-MC i genpromotorer förknippas i allmänhet med transkriptions förtryck, medan frånvaron är associerad med transkriptionsaktivitet 2.
Enorma framsteg har gjorts i vår förståelse av den roll som DNA-metylering i utveckling 3, transgeneration förökning av epigenetiska profiler 4, cancer patogenes 5,6, och ett antal andra forskningsområden. Många av dessa framsteg har kommit under de senaste åren som nya metoder har utvecklats för att profilera DNA-metylering 7. Med tillkomsten ochpopularisering av nästa generations sekvensering (NGS) tekniker finns det nu ett antal metoder för att profilera DNA-metylering över en hela genomet eller stora regioner i ett genom 8. Dessa tillvägagångssätt öppnar möjligheten till upptäckts studier som kvantifierar DNA metyleringsmönster och skillnader i DNA-metylering. Utöver dessa hypotesgenere metoder, det finns ett stort behov av riktade / hypotestestning DNA metylering kvantifiering metoder.
Pyrosequencing, metylering specifik PCR, och direkt Sanger-sekvensering av bisulfit konverterade DNA har varit de mest använda metoderna för analys av riktade områden (dvs, en promotorregion av en enda gen eller en CpG ö) 9-12. Alla dessa metoder är beroende av bisulfit konvertering, en kemisk deaminering reaktion där ometylerade cytosin s omvandlas till uracil-talet, medan metylerade cytosin s förbli intakt 13,14. PCR-amplifiering av bisulfite-konverterade DNA-resultat i ersättning av uracil-talet med tymin 15 medger differential metylering att läsa ut som en bas skillnad. Medan mycket användbart, de begränsningar i dessa metoder är låg kvantitativ exakthet, kort läslängd, och låg provkapacitet. För att lösa dessa begränsningar vi utvecklat en metod som vi har kallat Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS) 16. Målet med denna metod är att kunna analysera målgruppiska regioner av intresse i ett stort antal prover med höga kvantitativ noggrannhet.
BSAS använder delar av befintliga metoder (bisulfite konvertering och regionspecifika PCR-amplifiering) och kombinerar dem med enkla nästa generations bibliotekskonstruktion (transposome-medierad) 17 och bänk NGS 18 (Figur 1). Denna metod ger en mer kvantitativ och högre genomströmning metod för att undersöka cytosin metylering i någon region av intresse. Här presenterar vimetod i detalj och beskriva metoder för felsökning och kvalitet kontrollera BSAS processen.
BSAS möjliggör fokuserad, noggrann DNA-metylering kvantifiering med hög genomströmning kapacitet i både antal prover och antal mål. Dessutom detta bibliotek generation använder transposome-medierad tagmentation kräver mindre input DNA, är snabbare och innehåller färre steg än traditionell kapning och efterföljande adapter ligeringstekniker. Dessa förbättringar jämfört med befintliga metoder möjliggör exakt bas-nivå DNA-metylering analys av eventuella mål av intresse. Dessutom ger BSAS en ny metod för bekräftelse av regioner av intresse (differentiellt metylering regioner (DMRs), CpG-öar, regulatoriska regioner) som har identifierats med hjälp av hela genomet bisulfit 22 eller fånga 23 tillvägagångssätt. Använda ortogonala bekräftelse metoder och mer kvantitativt exakta metoder förbättrar analytiska stringens av epigenomiska studier. Den höga lästa djupet uppnås med BSAS tillåter en exakt kvantifiering i en smal konfidensintervall, reha hört i exakt kvantifiering 16. Dessutom kan möjligheten att köra många prover i ett enda experiment öka provstorleken för bekräftelser av hela genomet metoder, vilket kommer att öka den statistiska kraften; en svaghet i många nuvarande epigenetiska studier. Viktigt ger BSAS en bas specifik CpG metylering kvantifiering, vilket möjliggör generering av testbara hypoteser för epigenetisk forskning. Hypoteser som ökad metylering vid en specifik svarselement kommer att resultera i minskad bindning av en specifik transkriptionsfaktor. BSAS, kombinerat med parade mRNA expressionsdata, ger en metod för att erhålla både epigenetisk reglering och mRNA uttryck i en enda bit vävnad eller cellpopulation. Kopplade mätningar av reglering och uttryck ökar också den vetenskapliga stringens och effekterna av resultaten.
Kritiska steg inom BSAS protokollet inkluderar primer design, amplikon optimering och bibliotek generation /QC. PCR partiskhet införs om primers inte är utformade på rätt sätt och förstärker på olika effektivitet 8. Användningen av metylering standarder, såsom enzymatiskt genererade 100% och 0% cytosin metylerade standarder, kan användas för att bestämma graden, om någon, av metylering kvantifiering partiskhet, och är en riktig metod kontroll vid kvantifiering metylering 16. På samma sätt bör man vara försiktig när man optimerar PCR-reaktioner för att generera en enda hög kvalitet amplicon. Om ingen amplikon är närvarande med hjälp av de föreslagna riktlinjerna anges i protokollet, optimeringssteg inkluderar ökande PCR cykelnummer eller bsDNA ingångsbelopp. Om det finns flera PCR-produkter, inklusive primerdimerer, optimeringssteg inkluderar minskande bsDNA ingångsbelopp, minskar de PCR primer molära inmatningskoncentrationer, ökar glödgningstemperaturer, eller minska PCR-cykel nummer. Ett eller en kombination av dessa optimeringsförfaranden ger tillräckliga resultat för att generera en enda high-kvalitet amplicon. Alternativt omkonstruktion primers är en bra metod för primeruppsättningar som inte ger en enda amplikon. För de regioner där redesign är inte lämpligt eller möjligt, degenererade primeruppsättningar inklusive både cytosin s och tymin s vid CpG platser i termins primers och adenin-talet och guanin-talet på CpG platser i omvända primers kan fungera. Men dessa primeruppsättningar behöver ytterligare optimering för att säkerställa att ingen PCR partiskhet sker, en process som inte omfattas av detta protokoll. Bibliotek Kvalitet är oerhört viktigt för att lyckas. Se till att QC åtgärder genomförs för att bestämma storlek, kvalitet och kvantitet av biblioteken innan sekvensering. Sekvenseringsreaktioner är benägna att misslyckas med inmatning av biblioteken låg kvalitet. Bias i metylering kvantifiering kan mildras genom att säkerställa att metylering frekvenser är närvarande i både framåt och bakåt sekvense läser. Dessutom bör tiotals baser inriktnings till CpG platser kvalitets vara ≥Q30 för hög confidence i kvantifiering. Medan andra har visat tidigare liten eller ingen bias i tagmentation reaktioner av bisulfit konverterade DNA 19, se till måtten ovan beskrivna medger bekräftelse av låga partiskhet metylering kvantifiering.
BSAS mäter idag metylering vid CpG platser, dock kommer framtida utbyggnader av denna metod tillåter parade mätningar av CpG 5-HMC med tillägg av experimentella åtgärder skiljer mellan 5-MC och 5-HMC t.ex. införa kalium perrutenat innan bisulfite konvertering 24. Detta kommer att öka effekten av BSAS användbarhet genom att tillåta parade metylering, både 5-MC och 5-HMC och expressionsdata för att bestämma genuttryck reglerande roller DNA-metylering. Transposome-medierad bibliotek beredning av PCR amplikoner leder till minskad sekvensedjup i ändarna av förstärkta regioner. Därför bör regioner med hög ränta utformas för att bosätta sig i mitten av amplikoner. Hurnågonsin, eftersom BSAS genererar sekvense läste djup> 1,000 X, den kvantitativa noggrannhet på 5-MC mätningar nära ändarna av förstärkta regioner är fortsatt hög.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |