ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

Summary

ゼブラフィッシュ角膜実質は植片から細胞シートに移行し、上皮の創傷治癒の文脈における集団的細胞移動のメカニズムの研究のためのin vitroモデルを提供する。これらのプロトコルの詳細集団細胞遊走アッセイにおいて使用するための一次外植片培養を確立するための効果的な方法。

Abstract

それらの固有の運動特性のために、魚の角膜実質細胞は、外植片培養物から解離長い単一細胞移動のメカニズムを研究するために使用されている。植片が確立されている場合しかし、これらの細胞はまた、個体が、移行を研究するための魅力的なモデルを角膜実質にする機能の多くを維持し、一括して移動：運動性の急速な速度、垂直アクチンケーブルとの広範なアクチンに富むラメラ、かつ比較的一定の速度をと移動の方向。初期の外植片では、集合的に移行するものと個別に移動する細胞の迅速な相互変換は、移行のモードを決定する際に、細胞 – 細胞接着の役割の研究を可能にし、移動の二つのモードの間の分子リンクを強調している。間葉への移行上皮が発生し、創傷治癒および炎症に関連する遺伝子が差次的に発現されるように、後に外植片中の細胞を迅速かつ集合的に移行する能力を失う。したがって、角膜実質細胞の外植片、皮膚創傷治癒の間に起こる遺伝子発現の変化の定義されたプログラムのコンテキストで集合的細胞移動のメカニズムを研究するための独自のシステムを表すことができ、再上皮化のためのインビトロモデルとして働くことができる。変異体およびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の様々な、利用可能な外植片は、異なる遺伝的背景を持つ魚から確立されることを可能にする。これは、これらのプロセス内の異なるタンパク質の役割を一意にアドレス指定することを可能にする。ここで概説プロトコルは、集団細胞遊走に関連する種々のアッセイで使用するためにこれらの外植文化を確立するための簡単​​かつ効果的な方法を記載する。

Introduction

細胞運動性の研究は、伝統的に、個別に移動する細胞に集中している。魚や両生類外植片からの培養された角膜実質^1-6に^近づく実験的および数学的モデリングの両方を使用して、細胞運動のメカニズムを研究するための強力なモデル系であることが判明している。均一な形状、速度、および方向を維持しながら、個別に移動する細胞に対する実験研究は、細胞の急速な、滑らかな滑走運動によって補助される。特に、胚形成、創傷治癒、および転移の間に、細胞間結合を維持しながら、しかし、 インビボにおいて 、細胞は、しばしば集合的に移動する。したがって、集合的な細胞移動、細胞遊走のフィールド内の研究の成長とますます顕著領域である。これらの細胞の集合的な移行は、最近^7に記載されており、それは創傷治癒モデルにおいて、集団の細胞遊走を研究するための強力なシステムにする多くのユニークな特徴を有している。

ove_content ">スケールが麻酔され、成体ゼブラフィッシュから引き抜かれると、いくつかの上皮組織は、スケールの下側に取り付けられたままである。細胞培養培地は、これらの上皮細胞、または角膜を添加する場合、スケールからの集合的な単位として急速に移行する。ザ·移植片培養は、細胞が無傷の上皮を再確立するために離れて外植片から、彼らは、創傷床の暫定マトリックス全体に同じように移行するモデル治癒上皮創傷、と見ることができる。最近のデータは、このex vivoでの文化を模倣し、多くの機能を示唆しているin vivoで成体ゼブラフィッシュにおける創傷治癒。創傷閉鎖率は⁸ エキソビボ系⁷で観察されるものと同様の移動速度に変換する。また、 インビボでの創傷治癒モデル、ワルファリンによる治療は、止血率に影響を及ぼさないことを示唆している治癒、免疫応答を低下させるヒドロコルチゾンでの処置は再上皮^8を遅らせていない間</SUP>。スケールは動物から除去されたとき、ゼブラフィッシュが出血しないように、止血は主要なプレーヤーではない。私たちは外植で免疫細胞を発見したが、我々は彼らが集団的細胞遊走に与えるかもしれない影響を研究していません。

ここで紹介するプロトコルは、多くの生物学的アッセイで使用するための一貫性と再現性を確保するゼブラフィッシュ角膜実質植片培養を確立する方法について説明します。これらの外植片培養は、いくつかの理由のために集団的細胞移動のためのin vitroモデルでは特に魅力的である。まず、ゼブラフィッシュ角膜実質は外植文化を確立する時間以内に使用される主要な細胞である。したがって、これらの細胞は、初代細胞^9-13の通路に関連付けられた形態学的および遺伝子発現の変化を受けていない。第二に、このシステムは、創傷への応答、間葉trの上皮の一部として^、14が負傷に応答して、再上皮化の研究のためのモデルを表すと遺伝子発現の変化および細胞骨格再配列^14,15によって証明されるようにansition（EMT）プロセスが開始される。したがって、未処理の細胞において生じる遺伝子発現と運動性の背景の変化が特徴づけおよび処置変化を解釈するためのコンテキストを提供してきた。また、魚の角膜実質とヒトケラチノサイトは、機能的に同等である。両方は、それぞれの種の主要な上皮細胞である上皮創傷治癒において重要な役割を果たしている。第三に、大人のゼブラフィッシュは、黒色腫および他の癌^19-21、8,14および組織再生^22-24治癒皮膚の創傷を含むヒト疾患^16-18の様々なモデル系として認識を得ている。

このモデルシステムの技術的利点は、同じように魅力的である。突然変異体およびトランスジェニック系統が増え、非営利、集中型の施設から利用できます。具体的には、ゼブラフィッシュ変異プロジェクト（ZMP）ウェルカム·トラスト·サンガー研究所では、ゼブラフィッシュゲノム中のすべてのタンパク質をコードする遺伝子中にノックアウト対立遺伝子を作成することを目指しています。現在、彼らは特徴付け24088アレルで、11892遺伝子、ゲノムの約45％に変異している。また、ZMPは提案を受け入れ、無償でノックアウトを生成します。幼虫と大人のゼブラフィッシュ^25-28における遺伝子ノックダウンの最近の方法は、トランスジェニックアプローチが問題か、非現実的であるために発生上重要な遺伝子の機能を研究するための柔軟性を提供する。

〜145ミクロン/ hrの運動性の彼らの非常に急速な速度に起因する間もなく文化²⁹の設立後、アッセイは（通常は24時間以内に）迅速に完了することができます。実験は迅速に完了することができ、培養物を室温で十分に成長するにつれ、ビデオ顕微鏡を含む哺乳動物細胞遊走アッセイに関連する技術的なハードルのいくつかは回避される。また、研究予算を締めるの時代に、zebrafISHは、容易かつ安価に維持されている。

外植片の構造と動作は複雑である。スケールが除去されると、魚が出血しないように、表面的な表皮層よりもはるかに規模で除去するとは考えにくい。角膜実質細胞の大部分は抗E-カドヘリン抗体¹⁴を染色するために表示されるスケールは、最初に魚から除去されるときに、外植片における優勢な細胞型であるように見える。さらに、免疫蛍光¹⁴によってビメンチン染色の欠如によって判断されるように、最初の培養における線維芽細胞の証拠はない。しかし、繰り返しスケール除去と、（ ビデオ1を参照） を植片における多数の好中球があるように思われる。 LPSにさらされたとき、我々は、それらのサイズ、急速に運動性、および細胞シートのうち、それらの移動の形態学的観察に基づいて、好中球のような、これらの細胞を同定した（データは示さず）。さらに、これらの細胞は明るくウィットを染色好中球サイトゾル因子ならびにとともに、それらがその表面上に豊富なFcRを有することを示す二次IgG抗体の様々な抗体（データは示していない）時間。複数の細胞層が外植片内に存在する。共焦点顕微鏡は、上、下、及び細胞角膜実質細胞シート間の可視好中球スケール付近の角膜実質層以上の前縁付近単層の存在を明らかにする。

初期の時点では、〜145ミクロン/ hrの初期レートでの外植片から角膜実質の集合的な移行を開始する多層外植分極しの端に、上の細胞。外植片によって覆われる領域が急速に増加し、シート内で、張力を拡散セルにつながる、前縁の進行速度の低下。リーダーとフォロワー細胞との間の迅速な相互変換は、シート⁷内で自然発生的に形成されたホールの形成及び閉鎖時の前縁で観察される。として外植片を用いて開始EMTプロセスは、シート断片を継続し、角膜実質細胞は、特殊化した、迅速な運動性を失う。遺伝子発現とEMTと一致して形態変化、創傷治癒、および炎症反応は外植は約10日間¹⁴のための実行可能な検討されて培養7日以内に発生する。

Protocol

このプロトコルは、実験動物の管理と使用に関するAVMA動物福祉の原則に準拠しており、中西部の大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 麻酔、機器、およびメディアの作製約1.5（ペット店で入手可能）のどちらか、市販の脱塩剤を使用した水道水のLまたは24時間水スタンドをさせることにより、脱塩素。 3 1Lのビーカーを取得し、?…

Representative Results

図1に示すように、角膜実質細胞のシートは、移植片培養を確立するための時間以内にスケール直下からの移行を観察することができる。時折、集合的に移行するシートから離れて壊れて個別に移行する角膜実質を観察することができる。外植片が以前に摘み取られ​​ていた魚から確立されたように加えて、シートを通って移動する豊富な好中球があります。より長い培養期間…

Discussion

培地の添加の前に、3分間 – 角膜実質細胞移植片培養を成功させるために最も重要なステップは、スケールが約2の培養皿に付着させている。スケールの約75％が、シート（各実験のために確立培養の数はそれに応じて調整する必要がある）に付着し成長する。角膜実質細胞シートは、魚から除去し、いくつかの理由のために培養にあらゆる規模の周りに形成しない。まず、外植のDAPI染色は、?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm  thickness is best for coverslip removal.  14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.