Zebrafish queratinócitos explantes para estudar migração celular Collective e reepitelização na cicatrização de feridas cutâneas

Resumo

Ceratócitos Zebrafish migrar em folhas de células a partir de explantes e proporcionam um modelo in vitro para o estudo dos mecanismos de migração celular colectiva no contexto da reparação epitelial. Estes protocolos detalhe uma maneira eficaz para estabelecer culturas de explantes primários para utilização em ensaios de migração de células coletivas.

Resumo

Devido às suas propriedades únicas motilidade, ceratócitos de peixe dissociadas a partir de culturas de explantes têm sido usadas para estudar os mecanismos de migração de célula única. No entanto, quando explantes são estabelecidas, estas células também se movem coletivamente, mantendo muitas das características que tornam indivíduo queratócitos um modelo atraente para estudar a migração: as rápidas taxas de motilidade, extensa lamelas ricos em actina com um cabo de actina perpendicular e velocidade relativamente constante e direcção da migração. No início dos explantes, a rápida interconversão de células que migram individualmente com as que migram colectivamente permite o estudo do papel de adesões célula-célula na determinação do modo de migração, e enfatiza as ligações moleculares entre os dois modos de migração. As células em explantes posteriores perdem a capacidade de migrar rapidamente e coletivamente como um epitelial para mesenquimal ocorre e genes associados com a cicatrização de feridas e inflamação são diferencialmente expressos. Assim, os explantes de ceratócitos pode servir como um modelo in vitro para a re-epitelização que ocorre durante a cicatrização de feridas cutâneas e pode representar um único sistema para estudar os mecanismos de migração celular colectiva no contexto de um programa definido de alterações da expressão do gene. Uma variedade de linhas de peixe-zebra mutantes e transgênicos estão disponíveis, o que permite que explantes de ser estabelecida a partir de peixe com diferentes origens genéticas. Isto permite que o papel de proteínas diferentes dentro destes processos a serem endereçados com exclusividade. Os protocolos descritos aqui descrevem um método simples e eficaz para o estabelecimento destas culturas de explantes para utilização numa variedade de ensaios relacionados com a migração de células colectiva.

Introdução

Estudos da motilidade celular tradicionalmente focada em células que migram individualmente. Queratócitos cultivadas a partir de peixes e explantes de anfíbios têm provado ser um poderoso sistema modelo para estudar os mecanismos de motilidade celular utilizando a modelagem tanto experimental e matemática aproxima ^1-6. O trabalho experimental em células migratórias individualmente é auxiliado pelo movimento de deslizamento rápido, suave das células, mantendo ao mesmo tempo uma forma uniforme, a velocidade ea direcção. No entanto, in vivo, as células frequentemente mover-se em conjunto enquanto se mantém junções célula-célula, particularmente....

Protocolo

Este protocolo está em conformidade com os princípios de bem estar animal AVMA para o cuidado e uso de animais de laboratório e foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Midwestern.

1. Preparação de Anestesia, Equipamento, & Media

1. Dechlorinate aproximadamente 1,5 L de água da torneira usando um agente comercial dechlorinating (disponível em lojas de animais) ou deixando água parada por 24 horas. Obter três taças 1 L e encher cada uma com 500 ml água sem cloro. Rotular um para a realização de peixe antes de qualquer procedimento e outro para a recuperação. Para o terceiro balão, adici....

Resultados

Como ilustrado na Figura 1, as folhas de queratinócitos pode ser observado a migração para fora de debaixo da escala dentro de horas, que estabelece a cultura de explantes. Ocasionalmente, um queratinócitos migrar individualmente que rompeu com a folha de migrar coletivamente podem ser observados. Além disso, como o explante foi estabelecida a partir de um peixe que tinha sido previamente arrancado, existem neutrófilos abundantes que migram através da folha. Em períodos mais longos de cultura, os fragme.......

Discussão

A etapa mais importante para o sucesso da cultura de ceratócitos explante é permitir que a escala de aderir à placa de cultura para cerca de 2 - 3 minutos antes da adição do meio de cultura. Aproximadamente 75% de escamas irá aderir e crescer folhas (o número de culturas estabelecidas para cada experimento terá de ser ajustado em conformidade). Folhas de queratinócitos não formar em torno de cada escala removido do peixe e colocadas em cultura por vários motivos. Em primeiro lugar, coloração DAPI explantes revela que al.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pratos de Cultura com Fundo de Vidro de 35 mm (Revestido com Poli-D Lisina)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm de espessura é melhor para remoção de lamínula. 14 mm de diâmetro proporciona mais área de cultura.
Pinça Estilo Joalheiro Suíço, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	Descobrimos que pinças estreitas e finas funcionam melhor para a remoção de incrustações.