Zebrafish의 각막 실질 세포의 Explants는 피부 상처 치유에 집단 셀 마이그레이션 및 재 상피화을 연구하는
Summary
Zebrafish의 각막 간질 세포는 외식에서 세포 시트에서 마이그레이션 상피 상처 치유의 맥락에서 집단 세포 이동의 메커니즘 연구를위한 체외 모델을 제공합니다. 이러한 프로토콜 세부 집단 세포 이동 분석에 사용하기위한 기본 이식편 배양 물을 확립 할 수있는 효과적인 방법.
Abstract
때문에 고유 운동성 특성, 물고기 각막 간질 세포가 이식편 문화가 긴 하나의 세포 이동의 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다에서 해리. 운동의 빠른 속도, 수직 굴지의 케이블로 광범위한 액틴 풍부한 라멜라, 비교적 일정한 속도 : 외식이 설정되어 그러나,이 세포는 개인이 마이그레이션 연구하는 매력적인 모델을 각막 간질 있도록 많은 기능을 유지, 집단적으로 이동 이주의 방향. 초기 이식편에서, 집합 적으로 이러한 마이그레이션 마이그레이션 개별적 세포의 신속한 상호 마이그레이션의 모드를 결정하는 단계에서 세포 – 세포 유착의 역할에 대한 연구를 허용하고, 이동의 두 모드 사이 분자 링크를 강조한다. 중간 엽 전환에 상피가 발생하여 상처 치유 및 염증과 관련된 유전자가 발현 된대로 나중에 절편의 세포는 신속하고 집단적으로 마이그레이션 할 수있는 능력을 상실. 따라서, 각막 이식편은 피부 상처 치유 중에 발생하며 유전자 발현 변화 정의 프로그램의 맥락에서 집단 세포 이동의 메커니즘을 연구하는 독특한 시스템을 나타낼 수 상피화위한 시험 관내 모델이 될 수있다. 돌연변이 형질 전환 제브라 피쉬 라인의 다양한 사용할 수 있습니다 외식 서로 다른 유전 적 배경을 가진 물고기를 설립 할 수있다. 이는 이들 공정 내에서 다른 단백질의 고유 역할 해결 될 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 집단 세포 이동과 관련된 다양한 분석법에 사용하기 위해 이들 체외 이식편 배양 물을 형성하기위한 간단하고 효과적인 방법을 설명한다.
Introduction
세포 운동성의 연구는 전통적으로 개별적으로 마이그레이션하는 세포에 초점을 맞추고있다. 물고기와 양서류 외식에서 배양 된 각막 간질 세포는 1-6 접근 실험과 수학적 모두 모델링을 사용하여 세포 운동성의 메커니즘을 연구 할 수있는 강력한 모델 시스템을 입증했다. 균일 한 형상, 속도 및 방향을 유지하면서 개별적 세포 이주에 대한 실험은 세포의 빠른 부드러운 글라이딩 운동에 의해 도움을 받는다. 특히 배아, 상처 치유 및 전이 과정, 세포 – 세포 접합을 유지하면서 그러나, 생체 내에서 세포 자주 집단적으로 이동합니다. 따라서, 집단 세포 이동은 세포 이동의 분야 내에서 연구의 성장과 점점 더 눈에 띄는 지역이다. 이러한 세포의 집단 이주는 최근 7을 설명하고 그것이 상처 치유 모델에서 집단 세포의 이동을 연구 할 수있는 강력한 시스템을 만들어 많은 독특한 기능을 가지고 있습니다.
ove_content "> 비늘이 마취 성인 지브라 피쉬로부터 축출 될 때, 어떤 상피 조직은 규모의 밑면에 부착 된 상태로 유지. 세포 배양 배지가 첨가되고, 이들 상피 세포 또는 각막을 스케일에서 집단 단위로 급속하게 이동한다.을 절편 배양 세포들이 손상 상피을 다시 침대 상처의 임시 매트릭스에 걸쳐처럼 절편에서 멀리 이동하는 상피 상처 치유 모델로 볼 수있다. 최근 데이터가 제안이 체외 배양 모방의 많은 기능이 생체 내에서 성인 제브라 피쉬 상처 치유. 상처 봉합 률 8 생체 시스템 (7)에서 관찰 된 것과 유사한 이동 속도를 번역. 또한, 생체 내 상처 모델 치유, 와파린 치료 지혈이 속도에 영향을 미치지 않는다는 점을 시사 하이드로 코르티손과 치료 면역 반응을 감소시키는 동안의 치유, 재 상피화 8을 지연시키지 않는다 </> SUP. 규모가 동물로부터 제거 될 때 출혈 지브라 피쉬하지 않으므로, 지혈 주요 플레이어 아니다. 우리가 외식에 면역 세포를 발견했지만, 우리는 그들이 집단 세포의 이동에 미칠 수있는 영향을 연구하지 않았습니다.여기에 제시된 프로토콜은 많은 생물학적 분석에 사용 일관성과 재현성을 보장 제브라 피쉬 각막 이식편 문화를 구축하는 방법에 대해 설명합니다. 이 절편 문화는 여러 가지 이유로 집단 세포의 이동에 대한 체외 모델에서 특히 매력적인 있습니다. 첫째, 제브라 피쉬의 각막 간질 세포가 이식편 문화를 확립 시간 이내에 사용 일차 전지이다. 따라서, 이들 세포는 일차 전지 9-13의 통로와 관련된 형태 학적 및 유전자 발현 변화를 겪은 않았다. 둘째로,이 시스템은 상처에 대한 반응, 간엽 TR에 상피의 일부로서, 14 부상에 응답 상피화의 연구를위한 모델을 나타내고유전자 발현의 변화 및 세포 골격 재 배열 (14,15)에 의해 입증 ansition (EMT) 프로세스가 시작된다. 따라서, 처리하지 않은 세포에서 발생하는 유전자 발현 및 운동의 배경 변경 특징 및 치료와 변화를 해석하는 컨텍스트를 제공하고있다. 또한, 물고기 간질과 인간의 각질 세포는 기능적으로 동일; 모두는 각 종의 기본 상피 세포이며 상피 상처 치유에 중요한 역할을한다. 셋째, 성인 제브라 피쉬는 흑색 종 및 기타 암 19 ~ 21, 8, 14 및 조직 재생 22-24 치유 피부 상처를 포함하여 인간의 질병 16-18의 다양한 모델 시스템으로 인정 받고있다.
이 모델 시스템의 기술적 인 장점은 동일하게 강력한이다. 돌연변이와 유전자 변형 라인의 증가는 비영리, 중앙 집중화 된 시설에서 사용할 수 있습니다. 특히, Zebrafish의 돌연변이 프로젝트 (ZMP) 웰컴 트러스트 생어 연구소에서는 제브라 피쉬 게놈 유전자를 코딩 모든 단백질 녹아웃 대립 유전자를 작성하는 것을 목표로하고있다. 현재, 이들은 24,088 대립 특징으로 11,892 유전자, 게놈의 약 45 %의 변이있다. 또한, ZMP는 제안을 받아 무료로 녹아웃을 생성합니다. 애벌레와 성인 zebrafish의 25 ~ 28 유전자 최저의 최근 방법은 형질 전환 방법에 문제 또는 실용적이지 않은 발달 중요한 유전자의 기능을 연구 할 수있는 유연성을 제공한다.
~ 145 μm의 / hr의 운동성 자신의 매우 빠른 속도로 인해 곧 문화 (29)의 설립 후, 분석은 (일반적으로 24 시간 이내에) 신속하게 완료 할 수 있습니다. 실험은 신속하게 종료하고 배양, RT에서 잘 비디오 현미경을 포함하는 포유 동물 세포 이동 분석법이 회피와 관련된 몇몇 기술적 장애물을 재배 할 수있다. 또한, 연구 예산을 긴축의 시대에, zebraf틱은 쉽게 저렴하게 유지됩니다.
이식편의 구조 및 동작은 복잡하다. 스케일이 제거 될 때 출혈 물고기가 없기 때문에, 그것은 표면 상피층보다 훨씬 더 스케일 제거되는 것 같지는 않다. 세포의 대부분이 안티 E-cadherin의 항체 (14) 염색 나타나는 규모가 처음 물고기에서 제거 될 때 각막 간질 세포는 이식편에서 지배적 인 세포 유형으로 나타납니다. 또한, (14)에 의해 면역 염색 멘틴의 부재로 판단 초기 배양 섬유 아세포의 증거는 없다. 그러나 반복 스케일 제거와 함께, 이식편 수많은 호중구있을 표시 (비디오 1 참조). LPS에 노출 될 때 우리는 그 크기, 급속 운동성 및 세포 시트 점 이동의 형태 학적 관찰에 기초 호중구 이들 세포를 확인 하였다 (데이터는 보이지 않음). 또한 이러한 세포는 밝은 지혜를 얼룩호중구 세포질 인자뿐만 아니라 그들과 그 표면에 풍부한 FcR에있는 것을 나타낸다 IgG를 이차 항체의 다양성에 항체 (데이터 미기재) H. 여러 세포층 이식편 내에 존재한다. 초점 현미경을 위, 아래, 및 간질 세포 시트 사이 보이는 호중구와 스케일 근처 각막 2 층 이상에 전연 근처 단층의 존재를 드러낸다.
이른 시점에서, ~ 145 μm의 / hr의 초기 속도에서 각막 이식편에서의 집단적인 이동을 개시하는 다층 이식편을 편광의 에지에서 셀. 이식편 적용 지역은 급속하게 증가 시트 내에서 긴장을 확산 셀에 선도하고, 최첨단의 사전의 감소 속도. 지도자와 추종자 세포 사이의 빠른 상호 전환은 시트 (7) 내에서 자발적으로 형성된 구멍의 형성과 폐쇄시 첨단에서 관찰된다. 로절편으로 시작 EMT 과정은 시트 조각과 각막 자신의 전문, 빠른 운동성을 잃고 계속. 유전자 발현 및 EMT와 일치하는 형태 학적 변화, 상처 치유 및 염증 반응은 외식이 약 십일 (14)에 대한 실행 가능한 것으로 간주되는과 문화의 7 일 이내에 발생합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배지의 첨가 전에 3 분 – 각막 이식편 배양의 성공을 위해 가장 중요한 단계는 스케일이 약 2 배양 접시에 부착 할 수있게된다. 비늘의 약 75 %가 부착하고 (각 실험에 대해 확립 된 배양의 수는 적절히 조절 될 필요가있을 것이다) 시트를 성장할 것이다. 각막 실질 세포 시트는 물고기에서 제거하고 여러 가지 이유로 문화에 배치 모든 규모의 주위에 형성하지 않는다. 첫째, 외식의 DAPI 염색 일부 규?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 연구 촉진 그랜트 EEH 연구의 중서부 대학 Office 및 교내 그랜트 KJL에게 수여 스폰서 프로그램에게 수여 보건 과학 중서부 대학에서 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
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