Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas

Summary

Queratocitos de pez cebra migran en láminas de células a partir de explantes y proporcionan un modelo in vitro para el estudio de los mecanismos de migración celular colectiva en el contexto de la cicatrización de la herida epitelial. Estos protocolos detalle una forma efectiva para establecer cultivos de explantes primarios para su uso en ensayos de migración celular colectivos.

Abstract

Debido a sus propiedades únicas móviles, queratocitos de pescado disociarse de largo se han utilizado cultivos de explantes para estudiar los mecanismos de la migración de células individuales. Sin embargo, cuando se establecen los explantes, estas células también se mueven en conjunto, manteniendo muchas de las características que hacen individuo queratocitos un modelo atractivo para estudiar la migración: las tasas rápidas de la motilidad, extensa laminillas actina-ricos con un cable de actina perpendicular y velocidad relativamente constante y dirección de la migración. En los primeros explantes, la rápida interconversión de células que migran de forma individual con aquellos que migran colectivamente permite el estudio del papel de las adherencias célula-célula en la determinación del modo de la migración, y hace hincapié en los enlaces moleculares entre los dos modos de migración. Las células en explantes posteriores pierden su capacidad de migrar rápidamente y colectivamente como un epitelial a mesenquimal se produce y genes asociados con la curación de heridas y la inflamación se expresan diferencialmente. Por lo tanto, los explantes de queratocitos pueden servir como un modelo in vitro para la reepitelización que se produce durante la curación de heridas cutáneas y puede representar un sistema único para estudiar los mecanismos de la migración celular colectiva en el contexto de un programa definido de cambios de expresión génica. Una variedad de líneas de pez cebra mutantes y transgénicos están disponibles, lo que permite explantes que se establecerán a partir de peces con diferentes antecedentes genéticos. Esto permite que el papel de las diferentes proteínas dentro de estos procesos que debe abordarse de forma única. Los protocolos descritos aquí describen un método fácil y eficaz para el establecimiento de estos cultivos de explantes para su uso en una variedad de ensayos relacionados con la migración celular colectiva.

Introduction

Estudios de la motilidad celular se han centrado tradicionalmente en la migración de las células de forma individual. Queratocitos cultivados de pescado y explantes de anfibios han demostrado ser un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos de la motilidad celular utilizando modelos experimentales y matemáticos enfoques ^1-6. El trabajo experimental en células que migran de forma individual es ayudado por el movimiento de deslizamiento rápida, suave de las células, mientras que mantiene una forma uniforme, la velocidad y dirección. Sin embargo, in vivo, las células se mueven frecuentemente colectivamente manteniendo al mismo tiempo las uniones célula-célula, en particular durante la embriogénesis, la cicatrización de heridas, y la metástasis. Por lo tanto, la migración celular colectiva es un área en crecimiento y cada vez más importante de la investigación en el campo de la migración celular. La migración colectiva de estas células ha sido recientemente descrito ⁷ y tiene muchas características únicas que lo hacen un potente sistema para estudiar la migración celular colectiva en un modelo de cicatrización de la herida.

ove_content "> Cuando escalas son arrancadas de un pez cebra adultos anestesiados, algo de tejido epitelial permanece unido a la parte inferior de la escala. Cuando se añade medio de cultivo celular, estas células epiteliales, o queratocitos, migran rápidamente como una unidad colectiva de la escala. La cultivo de explantes puede ser visto como un modelo de curación de heridas epiteliales, en la que las células migran desde el explante como lo harían a través de la matriz provisional de un lecho de la herida para restablecer un epitelio intacto. Los datos recientes sugieren que este cultivo ex vivo imita muchas características de in vivo la cicatrización de heridas en adultos de pez cebra. tasas de cierre de la herida ⁸ se traducen a una velocidad de migración similar a la observada en el sistema ex vivo ^7. Además, en una herida in vivo modelo de curación, el tratamiento con warfarina sugiere que la hemostasia no tiene ningún efecto sobre la tasa de de la curación, mientras que el tratamiento con hidrocortisona para reducir la respuesta inmune no retrasa reepitelización ⁸ </sup>. A medida que el pez cebra no sangra cuando se retira la escala del animal, la hemostasis no es un jugador importante. Aunque hemos encontrado células inmunes en explantes, no hemos estudiado los efectos que puedan tener sobre la migración celular colectiva.

El protocolo presentado aquí describe cómo establecer cultivos de explantes de queratocitos de pez cebra que garanticen la coherencia y reproducibilidad para su uso en muchos ensayos biológicos. Estos cultivos de explantes son particularmente convincente un modelo in vitro para la migración celular colectiva por varias razones. En primer lugar, los queratocitos de pez cebra son células primarias usadas dentro de los horarios de establecer cultivos de explantes. Por lo tanto, estas células no se han sometido a los cambios morfológicos y de expresión de genes asociados con el paso de las células primarias ^9-13. En segundo lugar, este sistema representa un modelo para el estudio de la reepitelización en respuesta a heridas y ^14, como parte de la respuesta a heridas, una epitelial a mesenquimal trproceso ansition (EMT) se inicia como se evidencia por los cambios en la expresión génica y reordenamientos del citoesqueleto ^14,15. Por lo tanto, los cambios de fondo en la expresión génica y la motilidad que se producen en las células no tratadas se han caracterizado y proporcionar un contexto para interpretar los cambios con el tratamiento. Además, la queratocitos pescado y el queratinocito humano son funcionalmente equivalentes; ambas son las células epiteliales primarias de sus respectivos especies y juegan un papel clave en la cicatrización de la herida epitelial. En tercer lugar, el pez cebra adultos están ganando reconocimiento como un sistema modelo para una variedad de enfermedades humanas ^16-18 incluyendo el melanoma y otros cánceres ^19-21, la curación de heridas cutáneas ^8,14 y el tejido de regeneración ^22-24.

Las ventajas técnicas de este modelo de sistema son igualmente convincente. Un creciente número de líneas mutantes y transgénicos están disponibles sin fines de lucro, instalaciones centralizadas. En concreto, el Proyecto Mutación pez cebra (ZMP) En el Wellcome Trust Sanger Institute tiene como objetivo crear un alelo nocaut en cada proteína del gen de codificación en el genoma del pez cebra. Actualmente, se han mutado 11.892 genes, aproximadamente el 45% del genoma, con 24.088 alelos caracterizados. Además, ZMP acepta propuestas y generará de forma gratuita knock-outs. Métodos recientes en caída gen en larvas y adultos de pez cebra ^25-28 proporcionan flexibilidad para estudiar la función de genes de desarrollo importantes para las que los enfoques transgénicos son problemáticos o poco práctico.

Debido a sus muy rápidas tasas de la motilidad de ~ 145 micras / hr poco después de establecimiento de cultivos ^29, los ensayos se pueden completar rápidamente (normalmente en 24 horas o menos). Como experimentos se pueden completar rápidamente y culturas crecen bien a TA, varios de los obstáculos técnicos asociados con la que se evitan los ensayos de migración de células de mamíferos que implican la microscopía de video. Además, en la edad de apriete presupuestos de investigación, zebrafish se mantienen fácilmente ya bajo costo.

La estructura y el comportamiento del explante es compleja. Como los peces no sangran cuando se retira la escala, es poco probable que mucho más que las capas epidérmicas superficiales se eliminan con la escala. Queratocitos parecen ser el tipo celular predominante en el explante, cuando las escalas se eliminan inicialmente a partir de los peces como la gran mayoría de las células parece teñir con un anticuerpo anti-E-cadherina ^14. Además, no hay evidencia de fibroblastos en el cultivo inicial a juzgar por la ausencia de tinción por inmunofluorescencia ¹⁴ vimentina. Sin embargo, con extracción repetida escala, parece que hay numerosos neutrófilos en el explante (ver video 1). Hemos identificado estas células como los neutrófilos basadas en las observaciones morfológicas de su tamaño, rápidamente la motilidad, y su migración fuera de la lámina de células cuando se exponen a LPS (datos no mostrados). Además, estas células se tiñen ingenio brillantesh un anticuerpo para el factor citosólico de neutrófilos, así como con una variedad de anticuerpos IgG secundarias, lo que indica que tienen abundantes FcRs en su superficie (datos no mostrados). Múltiples capas de células están presentes en el explante. La microscopía confocal revela la presencia de una sola capa cerca del borde que conduce a más de dos capas de queratocitos cerca de la escala con neutrófilos visibles por encima, por debajo y entre las hojas de queratocitos celular.

En los puntos de tiempo tempranos, las células en el borde del explante polarize multi-capa, iniciando la migración colectiva de los queratocitos del explante a tasas iniciales de ~ 145 micras / hr. El área cubierta por el explante aumenta rápidamente, dando lugar a la propagación de células, la tensión dentro de la lámina, y una disminución de la tasa de avance del borde de ataque. Interconversiones rápidos entre las células líder y seguidora se observan en el borde de ataque durante la formación y el cierre de los agujeros formados espontáneamente dentro de la hoja ^7. Como elEMT proceso iniciado con el explante continúa, los fragmentos de hoja y los queratocitos pierden su motilidad rápida especializada. La expresión de genes y cambios morfológicos consistentes con EMT, cicatrización de heridas y las respuestas inflamatorias se producen dentro de los 7 días de cultivo con explantes se consideran viables durante aproximadamente 10 días ^14.

Protocol

Este protocolo se ajusta a los principios de bienestar AVMA animales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad del Medio Oeste. 1. Preparación de anestesia, equipos, y medios de comunicación Declorar aproximadamente 1,5 L de agua del grifo usando un agente comercial declorinadora (disponible en tiendas de mascotas) o dejando reposar el agua durante 24 horas. Obtener tres va…

Representative Results

Como se ilustra en la Figura 1, hojas de queratocitos se pueden observar la migración hacia fuera de debajo de la escala dentro de hora de establecer el cultivo de explantes. De vez en cuando, un queratocitos migración individual que se ha desprendido de la hoja colectivamente migración se puede observar. Además, como el explante se estableció a partir de un pescado que habían sido hechas anteriormente, existen abundantes neutrófilos que migran a través de la hoja. En períodos de cultivo más l…

Discussion

El paso más crítico para el éxito del cultivo de explantes de queratocitos está permitiendo que la escala se adhiera a la placa de cultivo durante aproximadamente 2 – 3 minutos antes de la adición del medio de cultivo. Aproximadamente el 75% de las escalas se adherirá y crecer hojas (necesitará el número de cultivos establecidos para cada experimento que ajustarse en consecuencia). Hojas de queratocitos no forman alrededor de cada escala extraerán de los peces y se colocan en cultivo durante varias razones. En …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm  thickness is best for coverslip removal.  14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.