دليل لتوليد واستخدام hiPSC الشخصيات المستمدة لدراسة الأمراض العصبية
Summary
This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Abstract
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Introduction
دراسات التعبير الجيني للخلايا العصبية متباينة في المختبر من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) من قبلنا 1 وغيرها 2،3 تشير إلى أن الخلايا العصبية hiPSC تشبه الجنين بدلا من الكبار أنسجة المخ. في الوقت الحاضر، قد تكون النماذج القائمة hiPSC-أكثر ملاءمة لدراسة الاستعداد ل، بدلا من الميزات في وقت متأخر من، والأمراض العصبية. لقد ذكرت سابقا أن جزءا كبيرا من التوقيع الجيني لفصام الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC يتم حفظها في الفصام الخلايا الاصلية العصبية المشتقة من hiPSC (الشخصيات)، مشيرا إلى أن الشخصيات قد يكون نوع من الخلايا مفيدة لدراسة المسارات الجزيئية المساهمة في الفصام 1 . نحن وغيرنا وأفادت الهجرة الشاذة، وزيادة الإجهاد التأكسدي وأنواع الاكسجين التفاعلية، حساسية للضغوط البيئية عتبة الفرعية وظيفة الميتوكوندريا ضعف في الفصام hiPSC الشخصيات 1،4-6، وكذلك انخفضت العصبية جonnectivity وظيفة متشابك في الخلايا العصبية الفصام hiPSC 5،7-10. إذا كانت العوامل الجزيئية المساهمة في الهجرة الشاذة و / أو الاكسدة في الفصام hiPSC الشخصيات أيضا تكمن وراء اتصال الخلايا العصبية انخفاض في الفصام الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC، يمكن أن تكون الشخصيات السكان العصبي القوي وتنسخي للغاية مع الذي لدراسة الآليات المسؤولة عن المرض. وعلاوة على ذلك، لأن واحدا يمكن أن تولد بسرعة أعداد كبيرة من الخلايا وليس من الضروري الانتظار أسابيع أو أشهر لنضوج الخلايا العصبية، المقايسات مقرها NPC-هي مناسبة لدراسة الأفواج الكبيرة المرضى واكثر سهولة في ارتفاع الفرز الإنتاجية. ونحن نعتقد أن hiPSC الشخصيات يمكن أن تكون بمثابة وكيل لمسارات التنمية المحتمل أن تساهم في التسبب بالمرض، كما سبق أن تظاهروا في اضطرابات متنوعة مثل انفصام الشخصية (1) وهنتنغتون المرض 11.
للتمييز الشخصيات من hiPSCs، العصبية الأولية فيويتم إنجاز الدرفلة الجديد من قبل المزدوج لل Smad تثبيط (0.1MM LDN193189 و 10mm SB431542) 12. عن طريق استعداء BMP و TGF يشير مع هذه الجزيئات الصغيرة، ويتم حظر الأديم الباطن ومواصفات الأديم المتوسط، وتسريع تمايز الخلايا العصبية ويؤدي إلى تشكيل ريدات العصبية واضحة خلال أسبوع واحد من الطلاء. يحدث الزخرفة العصبية في هذه العملية في وقت مبكر، ويفترض خلال فترة تشكيل ريدة العصبي وبعد ذلك مباشرة. في غياب العظة أخرى، تفترض هذه الخلايا العصبية البدائية لمثل الدماغ الأمامي مصير الأمامي 13. مباشرة بعد تشكيل ريدة العصبي، ومستمرة طوال التوسع مجلس الشعب، الشخصيات الدماغ المقدم تستزرع مع FGF2 8،14. لديهم إمكانات النسب المزدوجة، ويمكن أن تكون متباينة للسكان العصبي من 70-80٪ الخلايا العصبية III-تويولين إيجابية و20-30٪ ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) النجمية -positive (الشكل 1). الغالبية العظمى من الخلايا العصبية الدماغ الأمامي hiPSC هي-VGLUT1 إيجابية، وهكذا هي يفترض glutamatergic، على الرغم من أن ما يقرب من 30٪ من الخلايا العصبية هي-GAD67 الموجب (GABAergic) 8.
الشخصيات و passaged بشكل روتيني أكثر من عشر مرات في المختبر، مع الحفاظ على ملامح التمايز متسقة، وبدون تراكم التشوهات النمط النووي. وذكرت جماعات الشخصيات الركض أكثر من 40 مرة 15، ومع ذلك، نجد أن وراء عشر الممرات والشخصيات تظهر زيادة الميل للنجمية التمايز. الشخصيات جيدا يتسامح متعددة تجميد يذوب ويمكن تحويلها لزراعة كما neurospheres ببساطة عن طريق زراعة في لوحات غير ملتصقة. وtransduced الشخصيات بكفاءة عن طريق النواقل الفيروسية، التي تمكن من تقييم سريع للعواقب الجزيئية والخلوية من اضطراب وراثي، وقابلة للتوسيع بسهولة لانتاج مادة كافية للدراسات كيميائية حيوية. وعلاوة على ذلك، لأن ناقلات فيروسية قوية تسمح الإفراط في التعبير و / أو ضربة قاضية للجينات الأمراض ذات الصلة، في أي سيطرة أو المريض المستمدة neurخلايا القاعدة ويمكن للمرء أن استخدام هذه المنصة لاختبار تأثير الخلفية الوراثية على هذه التلاعبات. وإن لم تكن مناسبة لمتشابك أو فحوصات على أساس النشاط التي تتطلب الخلايا العصبية الناضجة، قد الشخصيات يكون بديلا عمليا لكثير من التحليلات الجزيئية أو البيوكيميائية واضحة من الخلايا المشتقة من المريض العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفناها الطرق التي يمكن من خلالها تمييز hiPSCs في اللجان التحضيرية الوطنية، وهو نوع من الخلايا العصبية التي يتم حفظها جزءا كبيرا من التوقيع الجيني للخلايا العصبية hiPSC المشتقة والتي قد تكون بمثابة وكيل لمسارات التنمية المحتمل أن تساهم في التسبب بأمراض 8، 11. بالإضا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| 2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
Referências
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
- Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
- Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
- Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
- Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
- Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
- An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington’s Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
- Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
- Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
