Summary

मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन के लिए उत्पन्न और का प्रयोग hiPSC व्युत्पन्न NPCs के लिए एक गाइड

Published: February 21, 2015
doi:

Summary

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Abstract

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Introduction

हमें एक से मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs) से इन विट्रो में भेदभाव न्यूरॉन्स और दूसरों 2,3 के जीन अभिव्यक्ति पढ़ाई hiPSC न्यूरॉन्स भ्रूण बजाय वयस्क के मस्तिष्क के ऊतकों जैसे लगते हैं कि संकेत मिलता है। वर्तमान में, hiPSC आधारित मॉडल बल्कि की देर सुविधाओं, मस्तिष्क संबंधी बीमारी से, करने के लिए गड़बड़ी के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। हम पहले NPCs के एक प्रकार का पागलपन एक योगदान करने के लिए आणविक मार्ग का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी सेल प्रकार हो सकता है यह दर्शाता है कि एक प्रकार का पागलपन hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की जीन हस्ताक्षर का एक महत्वपूर्ण अंश एक प्रकार का पागलपन hiPSC व्युत्पन्न तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs) में संरक्षित है सूचित किया है कि । हम और दूसरों को न्यायपालिका माइग्रेशन, बढ़ oxidative तनाव और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, उप दहलीज पर्यावरण तनाव और मानसिक असंतुलन में बिगड़ा mitochondrial समारोह hiPSC NPCs के 1,4-6 के प्रति संवेदनशीलता, साथ ही कमी हुई न्यूरोनल सी सूचना दी हैonnectivity और मानसिक असंतुलन hiPSC न्यूरॉन्स 5,7-10 में synaptic समारोह। एक प्रकार का पागलपन hiPSC NPCs में न्यायपालिका प्रवास और / या oxidative तनाव के लिए योगदान दे आणविक कारकों को भी एक प्रकार का पागलपन hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में कम न्यूरोनल कनेक्टिविटी आबाद हैं, NPCs के रोग के लिए जिम्मेदार तंत्र का अध्ययन करने के साथ जो एक मजबूत और अत्यधिक replicative तंत्रिका आबादी हो सकता है। एक तेजी से कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न कर सकते हैं और neuronal परिपक्वता के लिए हफ्तों या महीनों के इंतजार की जरूरत नहीं है, क्योंकि इसके अलावा, एनपीसी आधारित assays बड़ा रोगी साथियों के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं और उच्च throughput प्रदर्शन के लिए उत्तरदायी हैं। हम पहले से ही एक प्रकार का पागलपन एक और हंटिंग्टन रोग के रूप में 11 के रूप में विविध विकारों में प्रदर्शन किया गया है के रूप में hiPSC NPCs, संभावित रोग रोगजनन के लिए योगदान विकास के रास्ते के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकते हैं कि विश्वास करते हैं।

HiPSCs में प्रारंभिक तंत्रिका से NPCs के अंतर करने के लिएduction दोहरे SMAD निषेध (0.1mm LDN193189 और 10mm SB431542) 12 से पूरा होता है। इन छोटे अणुओं के साथ संकेत बीएमपी और TGF नाराज करके, अन्तर्जनस्तर और मेसोडर्म विनिर्देश neuronal भेदभाव को बढ़ाने और चढ़ाना के एक सप्ताह के भीतर दिखाई दे तंत्रिका rosettes के गठन के लिए अग्रणी, अवरुद्ध है। तंत्रिका patterning के संभवतः तुरंत बाद तंत्रिका थाली गठन और की अवधि के दौरान, जल्दी इस प्रक्रिया में होता है। अन्य संकेतों के अभाव में इन आदिम तंत्रिका कोशिकाओं को एक पूर्वकाल अग्रमस्तिष्क तरह भाग्य 13 मान। इसके तत्काल बाद तंत्रिका थाली गठन के बाद, और एनपीसी विस्तार भर में चल रहे, अग्रमस्तिष्क NPCs के FGF2 8,14 साथ सुसंस्कृत हैं। वे दोहरी वंश की क्षमता है और 70-80% तृतीय ट्यूबिलिन पॉजिटिव न्यूरॉन्स और 20-30% glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) -positive astrocytes (चित्रा 1) के तंत्रिका आबादी के लिए भेदभाव किया जा सकता है। अग्रमस्तिष्क hiPSC न्यूरॉन्स के बहुमत VGLUT1 पॉजिटिव हैंन्यूरॉन्स का लगभग 30% GAD67 पॉजिटिव (GABAergic) कर रहे हैं, हालांकि, और इसलिए, शायद glutamatergic हैं 8।

NPCs के नियमित लगातार भेदभाव प्रोफाइल को बनाए रखने, और कुपोषण असामान्यताएं जमते के बिना, जबकि इन विट्रो में अधिक से अधिक दस बार passaged कर रहे हैं। समूह passaging के NPCs के 15, तथापि, हम दस मार्ग से परे है, NPCs के अस्थिकणिका भेदभाव के लिए प्रवृत्ति में वृद्धि हुई बताते हैं कि लगता है और अधिक से अधिक 40 बार सूचना दी है। NPCs के कई फ्रीज thaws अच्छी तरह-सहन और केवल गैर-पक्षपाती प्लेटों में संवर्धन द्वारा neurospheres के रूप में विकसित करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। NPCs के कुशलता से जैव रासायनिक अध्ययन के लिए पर्याप्त सामग्री उपज के लिए तेजी से आनुवंशिक गड़बड़ी की आणविक और सेलुलर परिणामों का मूल्यांकन, और आसानी से विस्तार योग्य, सक्षम करने वायरल वैक्टर द्वारा transduced कर रहे हैं। इसके अलावा, क्योंकि वायरल वैक्टर की अनुमति मजबूत अधिक अभिव्यक्ति नियंत्रण या रोगी व्युत्पन्न Neur या तो में और / या रोग-प्रासंगिक जीनों के पछाड़ना,अल कोशिकाओं, एक इन जोड़तोड़ पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस मंच का उपयोग कर सकते हैं। अन्तर्ग्रथनी या परिपक्व न्यूरॉन्स की आवश्यकता होती है गतिविधि आधारित assays के लिए उपयुक्त नहीं है, हालांकि NPCs के मरीज व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं के कई सीधा आणविक या जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक व्यावहारिक विकल्प हो सकता है।

Protocol

1. hiPSC भेदभाव तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को आगे बढ़ें और मानव भ्रूण स्टेम सेल में hiPSCs का विस्तार (HES) मीडिया (1 टेबल) के सह-सुसंस्कृत एक माउस भ्रूण fibroblast (MEF) बड़े (लेकिन subconfluent) कालोनियों एक embryoid शरीर (?…

Representative Results

तंत्रिका rosettes के apico-बेसल ध्रुवीयता (चित्रा 1) के साथ neuroepithelial कोशिकाओं के दौर समूहों के रूप में उनकी विशेषता उपस्थिति से, एक brightfield माइक्रोस्कोप का उपयोग, आकृति विज्ञान पहचाना जा सकता है। NPCs के बहुत उच्च घ…

Discussion

हम NPCs में hiPSCs, एक तंत्रिका कोशिका प्रकार जिसमें hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की जीन हस्ताक्षर का एक महत्वपूर्ण अंश संरक्षित है और कहा कि संभावित रोग रोगजनन 8 के लिए योगदान विकास के रास्ते के लिए एक प्?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) Life Technologies  #21985-023
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

Referências

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Citar este artigo
Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

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